在HeLa細(xì)胞中研究LKB1和PTEN的相互作用.pdf

1、目的:LKB1(Liver Kinase B1)和PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是調(diào)控mTOR(mammalian Target of Rapamycin)信號(hào)通路的兩個(gè)抑癌因子。LKB1胚系突變導(dǎo)致普杰二氏綜合癥(Peutz-Jeghers Syndrome，PJS)，PTEN胚系突變導(dǎo)致常染色體顯性遺傳病考登癥(Cowden's Disea

2、se，CD)，這兩種疾病具有相似的臨床表征。一系列研究結(jié)果提示LKB1和PTEN之間可能存在相互作用。本研究通過構(gòu)建DsRed2-PTEN-LKB1三順反子表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，探究LKB1與PTEN之間的相互關(guān)系。
　　方法:以人肝總RNA為模板通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得eDNA模板，通過PCR分別擴(kuò)增得到lkb1、Pten基因序列，以pIRES2-EGFP載體為模板通過PCR擴(kuò)增獲得IRES2片段。利用pIRES2-DsRed

3、2載體構(gòu)建多順反子表達(dá)載體pIRES2-DsRed2-LKB1（縮寫為pIRL）、pIRES2-DsRed2-PTEN（縮寫為pIRP）和pIRES2-DsRed2-PTEN-IRES2-LKB1（縮寫為pIRPIL）。通過觀察紅色熒光結(jié)合Westernblot檢測(cè)確定雙順反子和三順反子載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后目的蛋白獲得表達(dá)，進(jìn)一步通過檢測(cè)LKB1對(duì)PTEN磷酸化水平及磷酸酶活性的影響來探究LKB1與PTEN間的作用。
　　結(jié)果:

4、通過PCR擴(kuò)增成功獲得了lkb1、Pten基因序列和IRES2序列?；趐IRES2-DsRed2載體成功構(gòu)建了多順反子表達(dá)載體pIRL、pIRP和pIRPIL，并且測(cè)序結(jié)果表明插入片段為完全正確序列。pIRL、pIRP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后檢測(cè)到紅色熒光，Western blot結(jié)果表明目的蛋白均獲得表達(dá)，PTEN磷酸化和磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果表明LKB1能顯著提高PTEN的磷酸化水平和磷酸酶活性。
　　結(jié)論:LKB1和PTEN之間