牙周炎對(duì)肥胖大鼠脂肪組織炎癥狀態(tài)的影響及其促胰島素抵抗機(jī)制初探.pdf

1、研究背景:
　　 肥胖作為一種亞健康狀態(tài)，與機(jī)體一些重要的生理指標(biāo)密切相關(guān)，如血脂，血壓，胰島素敏感性等，它是促進(jìn)機(jī)體發(fā)生某些慢性疾病如2型糖尿病(T2DM)和動(dòng)脈粥樣硬化的重要病理特征[1]。肥胖狀態(tài)下，機(jī)體最早發(fā)生的，也是最重要的病理改變就是脂肪組織的增生肥大，尤其是內(nèi)臟脂肪。目前已知，脂肪組織不僅僅是一個(gè)能量儲(chǔ)存器官，而且是具有活躍分泌功能的內(nèi)分泌器官[2]。脂肪組織可以分泌大量的細(xì)胞因子，這些因子統(tǒng)稱為脂肪細(xì)胞因子，它們

2、作為炎癥介質(zhì)和信號(hào)分子參與機(jī)體的能量代謝，免疫調(diào)控和炎癥介導(dǎo)[3,4]。
　　 在眾多脂肪細(xì)胞因子中，腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα，TNF-α)與白介素6(Interleukin6，IL-6)最早受到關(guān)注，并且被證實(shí)與胰島素抵抗和T2DM的病理機(jī)制有關(guān)。研究證實(shí)，在健康個(gè)體以及患有T2DM的個(gè)體體內(nèi)，脂肪組織中TNF-α的濃度均與空腹血糖，胰島素，甘油三酯的濃度以及胰島素抵抗有關(guān)[3，5，6]。IL-

3、6的表達(dá)在肥胖個(gè)體的脂肪組織中也明顯升高，并且是健康個(gè)體的10倍。脂肪組織是肥胖狀態(tài)下血清IL-6濃度的一個(gè)主要來源，30％的血清IL-6來自于脂肪組織。TNF-α和IL-6的聯(lián)合作用，增加了脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的溶解和脂肪酸的氧化，對(duì)脂肪組織的這種局部調(diào)控作用，最終促進(jìn)了外周組織的胰島素抵抗[7-10]。近年來，更多新的脂肪細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行研究，其中瘦素和脂聯(lián)素受到的關(guān)注最多。瘦素經(jīng)脂肪細(xì)胞分泌，進(jìn)入血循環(huán)，主要作用于下丘腦[11]，但

4、在胰島素敏感的外周靶器官如肝臟和骨骼肌中發(fā)現(xiàn)有瘦素受體的表達(dá)，說明瘦素參與了外周胰島素敏感性的調(diào)控。瘦素可通過自分泌和神經(jīng)內(nèi)分泌途徑兩種不同方式調(diào)控胰島素信號(hào)[12]。相反，脂聯(lián)素是所有脂肪細(xì)胞因子中唯一一個(gè)具有抗炎，保護(hù)血管內(nèi)皮功能和胰島素增敏作用[13-18]的細(xì)胞因子。脂肪細(xì)胞因子因此成為了聯(lián)系脂肪組織與全身病變，尤其是胰島素抵抗的關(guān)鍵紐帶。
　　 牙周炎是發(fā)生在口腔內(nèi)最常見的炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為牙周局部軟組織的破壞和骨

5、組織的吸收[19]。大量流行病學(xué)研究證實(shí)牙周炎與肥胖有關(guān)，縱向臨床研究也表明牙周炎的發(fā)展與體重指數(shù)(bodymassindex，BMI)的增加有關(guān)，并且使糖尿病患者糖化血紅蛋白的控制不[20-24]。在牙周炎，肥胖和T2DM之間，慢性炎癥狀態(tài)成為了其共同的病理機(jī)制。
　　 然而，牙周炎的局部炎癥反應(yīng)是否能造成機(jī)體胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展，或者在機(jī)體本身已存在病變?nèi)绶逝值那闆r下，牙周炎是否能加重機(jī)體的全身性的炎癥狀態(tài)，牙周炎參與胰島素

6、抵抗的調(diào)控機(jī)制是否與脂肪細(xì)胞因子有關(guān)，這些問題都尚未得到解決，而且人體學(xué)研究也無法完成這些研究。因此，我們采用建立疾病動(dòng)物模型的方法，研究牙周炎對(duì)機(jī)體炎癥狀態(tài)的影響，以及這種影響是否與機(jī)體的胰島素有關(guān)，從而揭示牙周炎與T2DM病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為臨床治療和預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　 第一章:牙周炎合并肥胖大鼠模型的建立
　　 目的:
　　 通過谷氨酸鈉(MSG)誘導(dǎo)建立肥胖大鼠模型，牙周局部結(jié)扎聯(lián)合涂菌建立牙周炎

7、模型;檢測肥胖大鼠的Lee's指數(shù)，血壓和血糖水平，評(píng)估大鼠的肥胖狀態(tài);Micro-CT掃描大鼠頜骨樣本并進(jìn)行三維重建，計(jì)算牙周結(jié)扎造成的線性和體積骨喪失量;HE染色評(píng)估牙周組織的病理改變。
　　 方法:
　　 (1)80只新出生的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為4組(n=20):牙周炎聯(lián)合肥胖組(OB+CP)，肥胖組(OB)，牙周炎組(CP)和正常對(duì)照組(C);
　　 (2)OB+CP組與O

8、B組的新生大鼠在出生后的第2，4，6，8，10天分別皮下注射MSG誘導(dǎo)肥胖，于12周齡時(shí)檢測體重，體長和血壓變化，取尾靜脈血測定空腹血糖濃度。判定肥胖模型成功建立的大鼠進(jìn)入牙周炎模型的建立;
　　 (3)OB+CP組與CP組的大鼠在局麻下結(jié)扎雙側(cè)上頜第一，第二磨牙，結(jié)扎處涂布四種牙周致病菌的混懸液，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性牙周炎8周;
　　 (4)20周齡時(shí)，處死所有實(shí)驗(yàn)大鼠，采集血清和組織樣本，頜骨樣本采用Micro-CT掃描，ED

9、TA脫鈣和HE染色。
　　 結(jié)果:
　　 本實(shí)驗(yàn)通過MSG藥物誘導(dǎo)新生大鼠，使其在成年期后表現(xiàn)出向心性肥胖，血壓升高，血糖異常等癥狀和體征，成功建立肥胖大鼠模型。采用絲線結(jié)扎雙側(cè)上頜磨牙并涂布牙周致病菌，經(jīng)8周的誘導(dǎo)，成功建立慢性牙周炎模型。兩種疾病模型在SD大鼠體內(nèi)成功復(fù)合。Micro-CT的三維重建顯示，結(jié)扎的牙周組織表現(xiàn)出明顯的線性和體積骨喪失量;HE染色切片顯示牙周組織附著喪失明顯，膠原纖維破壞，牙周袋底炎癥細(xì)胞

10、浸潤，肉芽組織形成，牙槽骨吸收明顯。
　　 結(jié)論:
　　 采用MSG誘導(dǎo)新生大鼠，可成功建立成年期肥胖大鼠模型，且該模型鼠表現(xiàn)出某些前糖尿病狀態(tài)的體征，該方法簡單，易行，重復(fù)性好，模型穩(wěn)定。絲線結(jié)扎聯(lián)合涂菌可誘導(dǎo)大鼠典型的牙周組織破壞，病理改變明顯，慢性炎癥狀態(tài)維持穩(wěn)定。
　　 第二章:牙周炎對(duì)大鼠內(nèi)臟脂肪組織炎癥狀態(tài)的影響
　　 目的:
　　 研究牙周炎對(duì)肥胖大鼠和非肥胖大鼠誘導(dǎo)內(nèi)臟脂肪組織的形

11、態(tài)學(xué)改變以及炎癥狀態(tài)變化的影響，探討牙周炎和肥胖對(duì)脂肪組織炎癥的聯(lián)合作用，為牙周炎參與調(diào)控肥胖相關(guān)性疾病的病理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 四組大鼠的內(nèi)臟脂肪組織經(jīng)福爾馬林固定后，制成6um的切片，分別用于HE染色，甲苯胺藍(lán)染色和CD68/CD14的免疫組化染色。軟件分析四組大鼠脂肪細(xì)胞個(gè)數(shù)和直徑的變化，血管基質(zhì)成分的增生以及CD68/CD14標(biāo)記的巨噬細(xì)胞的浸潤狀態(tài)。
　　 結(jié)果:
　　 四組

12、大鼠脂肪組織的HE染色結(jié)果顯示，和CP組與C組相比，OB+CP組與OB組大鼠的脂肪細(xì)胞數(shù)目增加，有顯著性差異(P＜0.05)，但OB+CP組與OB組之間(t=0.503，P=0.616)以及CP組與C組之間(t=0.215，P=0.830)的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OB組與OB+CP組的脂肪細(xì)胞直徑明顯大于C組和CP組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但C組與CP組(t=0.480，P=0.632)，OB組與OB+CP組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t

13、=0.773，P=0.441)。甲苯胺藍(lán)染色顯示OB+CP組大鼠脂肪組織中的血管基質(zhì)部分出現(xiàn)明顯的增生擴(kuò)張和炎癥細(xì)胞浸潤，而CP組的變化不明顯。比較四組大鼠脂肪組織中巨噬細(xì)胞的浸潤，OB+CP組的CD68蛋白表達(dá)明顯優(yōu)于OB組（t=3.944，P=0.000），且CP組的蛋白表達(dá)量也高于C組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.332，P=0.000）。脂肪組織中CD14蛋白的表達(dá)分析顯示，OB+CP組的平均光密度值高于OB組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

14、t=5.051，P=0.000);CP組與C組的脂肪組織內(nèi)偶見陽性染色細(xì)胞，CP組的平均光密度值高于C組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=3.382，P=0.000）。肥胖和牙周炎對(duì)大鼠脂肪組織中CD14蛋白的表達(dá)存在交互作用(F=7.481，P=0.007)。
　　 結(jié)論:
　　 肥胖可造成大鼠脂肪細(xì)胞的個(gè)數(shù)增加，體積增大，血管基質(zhì)擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤。而單純牙周感染，并不能引起脂肪細(xì)胞發(fā)生明顯的增生和肥大，但能使脂肪組織表現(xiàn)出輕

15、度的炎癥狀態(tài)，表現(xiàn)為脂肪組織中的血管基質(zhì)部分輕度增生，巨噬細(xì)胞浸潤增加。在聯(lián)合了肥胖后，牙周炎可使脂肪細(xì)胞發(fā)生更明顯的增生和肥大，并且血管基質(zhì)部分增生擴(kuò)張更明顯，巨噬細(xì)胞浸潤更嚴(yán)重?；谝陨献C據(jù)，我們認(rèn)為，慢性牙周炎癥可引起脂肪組織的輕度炎癥性改變，但不發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，但在機(jī)體本身存在炎癥的前提下，牙周炎對(duì)脂肪組織炎癥的加重具有促進(jìn)作用。
　　 第三章:牙周炎對(duì)脂肪細(xì)胞因子表達(dá)的影響及其與胰島素抵抗的關(guān)系
　　 目

16、的:
　　 檢測肥胖和非肥胖狀態(tài)下，牙周炎對(duì)瘦素和脂聯(lián)素這兩個(gè)關(guān)鍵的脂肪細(xì)胞因子在脂肪組織中表達(dá)的影響和血清濃度變化的影響，并分析這兩個(gè)脂肪細(xì)胞因子的局部和全身水平與機(jī)體胰島素抵抗的關(guān)系。
　　 方法:
　　 采用免疫熒光的方法標(biāo)記四組大鼠脂肪組織中瘦素和脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的變化，進(jìn)行半定量分析;ELISA法檢測大鼠血清中瘦素，脂聯(lián)素和胰島素的濃度;葡萄糖氧化酶法檢測血清中空腹血糖的濃度。根據(jù)空腹胰島素(mIU/L)

17、和空腹血糖(mmol/L)濃度計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型下的胰島素抵抗指數(shù)(homeostasismodelassessment-insulinresistance，HOMA-IR)，并采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估瘦素和脂聯(lián)素在脂肪組織和血清中的表達(dá)水平是否與機(jī)體的胰島素抵抗有關(guān)。
　　 結(jié)果:
　　 瘦素蛋白在OB+CP組大鼠脂肪組織中的表達(dá)量最高，顯著高于OB組（t=2.046，P=0.044）;CP組大鼠脂肪組織中的瘦素蛋白表

18、達(dá)高于C組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.237，P=0.000);血清中的瘦素水平與脂肪組織中的表達(dá)水平一致，OB+CP組高于OB組（t=11.197，P=0.004），CP組高于C組（t=7.156，P=0.000），差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。脂聯(lián)素蛋白在C組大鼠脂肪組織中的表達(dá)量最高，而OB+CP組中最低，CP組的脂聯(lián)素蛋白表達(dá)量顯著低于C組(t=-3.661，P=0.000)，OB+CP組低于OB組(t=-2.932，P=0.004)

19、，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;但OB+CP組的血清脂聯(lián)素濃度最高，高于OB組(t=3.624，P=0.003)，而CP組的血清脂聯(lián)素濃度略低于C組，但無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-1.323，P=0.207）。肥胖和牙周炎對(duì)脂肪組織中瘦素蛋白的表達(dá)(F=14.859，P=0.001)以及血清中瘦素（F=54.254，P=0.000）和脂聯(lián)素水平（F=5.191，P=0.024）存在交互效應(yīng)。
　　 OB+CP組大鼠的空腹血糖濃度高于OB組，差

20、別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=7.694，P=0.000)，CP組的血糖稍高于C組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.369，P=0.005）。胰島素的血清濃度在OB+CP組比OB組稍高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.658，P=0.521）;CP組血清中胰島素濃度高于C組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=6.462，P=0.000）。肥胖和牙周炎對(duì)空腹血糖存在交互作用(F=17.699，P=0.000)，但對(duì)胰島素水平不存在交互作用(F=1.606，P=0.215)。

21、
　　 HOMA-IR的評(píng)分顯示，從高到低依次為:OB+CP組＞OB組＞CP組＞C組。其中，OB+CP組的HOMA-IR得分高于OB組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.662，P=0.000);CP組的HOMA-IR得分高于C組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=9.992，P=0.000）。肥胖和牙周炎對(duì)大鼠HOMA-IR得分存在交互效應(yīng)(F=12.340，P=0.002)。大鼠脂肪組織中瘦素的表達(dá)水平與HOMA-IR呈正相關(guān)(r=0.844,

22、P=0.000)，隨著瘦素在局部脂肪組織中表達(dá)量的增多，大鼠機(jī)體的胰島素抵抗水平增高;脂肪組織中脂聯(lián)素蛋白表達(dá)水平與HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)（r=-0.886，P=0.000），隨著脂肪組織中脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的降低，胰島素抵抗水平升高;大鼠血清中的瘦素（r=0.875，P=0.000）和脂聯(lián)素(r=0.735，P=0.000)水平與HOMA-IR也呈正相關(guān)，隨著瘦素和脂聯(lián)素血清水平的不斷升高，大鼠機(jī)體的胰島素抵抗也加重。
　　 結(jié)論

23、:
　　 慢性牙周炎可誘導(dǎo)大鼠脂肪組織中瘦素和脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)失調(diào)，這種影響在合并了肥胖以后更為明顯。瘦素和脂聯(lián)素的血清濃度也受牙周炎的調(diào)控，并且牙周炎以及牙周炎聯(lián)合肥胖所造成的瘦素和脂聯(lián)素在局部和血清中水平的變化，與機(jī)體的胰島素抵抗密切相關(guān)，說明牙周炎可能通過調(diào)控脂肪組織表達(dá)瘦素和脂聯(lián)素，參與了機(jī)體胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。
　　 第四章:牙周炎對(duì)骨骼肌中脂肪細(xì)胞因子受體表達(dá)的影響
　　 目的:
　　 研究

24、各實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌中瘦素受體和脂聯(lián)素受體1蛋白的表達(dá)，探討牙周炎對(duì)胰島素靶組織中脂肪細(xì)胞因子受體表達(dá)的調(diào)控以及在骨骼肌胰島素抵抗中的作用。
　　 方法:
　　 采用免疫組化的方法標(biāo)記四組大鼠骨骼肌組織中瘦素受體和脂聯(lián)素受體1蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行半定量分析。
　　 結(jié)果:
　　 瘦素受體在C組和CP組的骨骼肌中廣泛表達(dá)，染色呈強(qiáng)陽性，而在OB組和OB+CP組骨骼肌組織中表達(dá)量減少，表達(dá)強(qiáng)度減弱，尤其是OB+C

25、P組中表達(dá)量最少。半定量分析顯示CP組與C組，蛋白表達(dá)量無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.272，P=0.786);但OB組中，瘦素受體的表達(dá)量顯著高于OB+CP組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.490，P=0.001）。肥胖和牙周炎對(duì)骨骼肌中瘦素受體的表達(dá)存在交互效應(yīng)（F=4.341，P=0.039）。
　　 OB+CP組大鼠骨骼肌中脂聯(lián)素受體1蛋白的表達(dá)最弱，而且表達(dá)量明顯低于OB組，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.470，P=0.

26、001）;CP組和C組骨骼肌切片中可見肌細(xì)胞的胞膜廣泛表達(dá)脂聯(lián)素受體1，但兩組之間的蛋白表達(dá)量未見顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.543，P=0.598)。肥胖和牙周炎對(duì)大鼠骨骼肌中脂聯(lián)素受體1的表達(dá)存在交互效應(yīng)(F=6.364，P=0.013)。
　　 結(jié)論:
　　 牙周炎的局部感染不能下調(diào)大鼠骨骼肌組織中瘦素受體和脂聯(lián)素受體1的表達(dá)，但在肥胖狀態(tài)下，牙周炎可促進(jìn)大鼠骨骼肌中瘦素受體和脂聯(lián)素受體1的表達(dá)明顯下調(diào)，這可能造成骨