松江鱸(Trachidermus fasciatus)抗氧化相關基因的克隆表達與功能分析.pdf

1、松江鱸是一種典型的降海洄游性魚類。歷史上，松江鱸分布范圍較廣。但是，隨著環(huán)境污染的加劇，松江鱸賴以生存和繁衍的生態(tài)環(huán)境遭到嚴重的破壞，現已被列入國家二級保護動物。人工養(yǎng)殖成為恢復其自然種群的重要途徑和手段，然而，松江鱸魚獨特的生物學和生理學特性，決定了它與其他魚類不同的病理、病癥特點。面對養(yǎng)殖過程中日益嚴重的病害問題，深入開展松江鱸免疫機制研究，并在此基礎上尋找松江鱸疾病防治的有效方法已成為當務之急。研究表明，生物體在受到病原和重金屬等

2、刺激時，因氧化應激體內產生大量的活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)。ROS在殺滅入侵的病原微生物的同時，由于其反應的非特異性，也會對宿主的細胞、組織和器官造成嚴重傷害，進而導致機體生理機能的損傷和免疫系統(tǒng)的破壞。所以，消除生物體內因過度免疫反應產生的過量ROS將能夠增強其抗病能力，有效地保護免疫器官和組織，抑制免疫細胞的凋亡，提高免疫力。
　　 硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)和過氧化物還原

3、酶(Peroxiredoxin，Prx)分別屬于生物體內非酶抗和酶抗氧化劑，在清除ROS過程中發(fā)揮重要作用。本論文采用RACE(RapidamplificationofcDNAends)技術從松江鱸體內克隆到了硫氧還蛋白1（TfTrx1）、硫氧還蛋白相關蛋白14(Thioredoxinrelatedprotein14，TfTRP14)和過氧化物還原酶1(TfPrx1)三種與免疫系統(tǒng)相關的抗氧化基因，分析了它們的分子結構特征，采用實時熒光

4、定量PCR(QuantitativerealtimePCR，qRT-PCR)檢測了三個基因的組織分布及LPS和重金屬刺激后的表達模式變化;同時，將三個基因連接到pET-30a(+)載體，實現了在大腸桿菌中的重組表達。獲得純化蛋白后，制各多克隆抗體，利用Westernblot檢測了LPS刺激后蛋白水平表達譜變化，并對蛋白活性進行了檢測。
　　 Trx是一種廣泛存在于生物體的具有氧化還原活性的酸性小分子蛋白質。松江鱸Trx1（TfT

5、rx1）cDNA全長為665bp，包括5'端非編碼區(qū)39bp，3'端非編碼區(qū)290bp，開放閱讀框336bp，編碼111個氨基酸。TfTrx1預測分子量為12.34kD，理論等電點(pI)為4.52。TfTrx1不含信號肽，與裸蓋魚的同源性為66％，序列中含有高度保守的活性位點序列CGPC(Cys-Pro-Asp-Cys)。二級結構含有5個β折疊和4個α螺旋，TfTrx1蛋白結構與人類Trx1結構非常吻合。通過Neighbor-join

6、ing方法構建的系統(tǒng)進化樹顯示，松江鱸Trx與裸蓋魚等魚類Trx1首先聚在一起，然后與其他脊椎動物Trx1聚為區(qū)別于Trx2的一大支，從而也證明我們克隆到的是松江鱸Trx1基因。RT-PCR檢測發(fā)現，TfTrx1在血、心、肝臟、鰓、胃、腸、皮膚、肌肉、腎、脾、腦、卵均有表達。LPS刺激后皮膚、肝臟、脾、和腦中TfTrx1轉錄水平存在明顯的上調。在蛋白水平，皮膚和肝臟中，LPS刺激后TfTrx1的上調表達比mRNA水平的上調持續(xù)更長時間。

7、重金屬刺激組，在所有檢測的組織（皮膚、肝臟、脾、鰓和腦）中，TfTrx1均在刺激后24h上調至最高峰。為進一步探討其生物學功能，我們構建了TfTrx1重組質粒，獲得了純化重組蛋白。熒光活性檢測發(fā)現，TfTrx1蛋白二硫鍵的還原能夠將色氨酸的熒光強度提高近2.6倍，這暗示色氨酸殘基周圍微環(huán)境的變化。胰島素二硫鍵還原酶活性檢測發(fā)現，TfTrx1蛋白在體外具有還原酶的活性，且活性具有一定的濃度依賴性。這說明TfTrx1在生理條件下，可作為一種

8、氧化還原酶，參與機體的免疫應答過程。LPS作用實驗發(fā)現，TfTrx1可以與LPS直接結合發(fā)生相互作用。細菌結合和凝集實驗發(fā)現，TfTrx1可能通過與LPS的作用而導致其具有結合和凝集革蘭氏陰性菌的活性。這暗示TfTrx1可能在抵抗LPS對組織、器官損傷，促進吞噬細胞吞噬作用等機體免疫防御中發(fā)揮作用。
　　 TRP14是具有Trx樣活性中心的硫氧還蛋白超家族成員。松江鱸TRP14(TfTRP14)cDNA序列全長945bp，開放閱

9、讀框為372bp，編碼由123個氨基酸組成的蛋白質。蛋白的預測分子量為14.11kD，理論等電點(pI)為5.45，沒有信號肽。多序列比對結果顯示TRP14具有高度保守的活性位點序列CPDC(Cys-Pro-Asp-Cys)，TfTRP14與裸蓋魚序列同源性高達90％。二級結構含有5個β折疊和4個α螺旋，TfTRP14蛋白結構與人類TRP14結構非常吻合。與TfTrx1相比，TfTRP14活性位點周圍包括一個延伸的α2-β2環(huán)和一個α3

10、a折疊區(qū)，這可能會導致兩種蛋白底物的特異性。實時熒光定量結果顯示，TfTRP14在各個組織均有表達，但是表達量高低具有組織特異性。LPS和重金屬刺激后，TfTRP14表達存在明顯上調，表明TfTRP14可能參與到松江鱸機體對微生物和重金屬的免疫防御中。為了驗證TfTRP14生物學活性，利用原核表達系統(tǒng)獲得TfTRP14重組蛋白，活性二硫鍵的還原能夠顯著的提高色氨酸殘基的熒光強度，但是胰島素二硫鍵還原酶活性顯著的低于TfTrx1，可能由于

11、TfTRP14與TfTrx1具有不同的氧化還原特點，因而使底物具有一定的差異性所致。
　　 由于絕大部分過氧化物還原酶在體內以硫氧還蛋白作為惟一的氫供體，因此又被稱為硫氧還蛋白過氧化物酶。松江鱸Prx1(TfPrx1)的cDNA序列全長1047bp，開放閱讀框為600bp，編碼199個氨基酸。TfPrx1預測分子量為22.35kD，理論等電點為6.42。多序列比對發(fā)現，TfPrx1含有Prx特征肽段“FYPLDFTFVCPTEI

12、”和“GEVCPA”，屬于典型的2-Cys型Prx。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示松江鱸Prx與其他物種的Prx1聚在一起，區(qū)別于Prx2分支，這證明我們克隆到的是松江鱸Prx1基因。TfPrx1在檢測的各個組織中都有表達，其中以腸中表達最強，其次為腦，而在肝臟和肌肉中的表達較弱。LPS和重金屬刺激后，TfPrx1在主要免疫器官和腦中均明顯上調表達，表明TfPrx1可能在抗氧化應激相關的機體免疫中發(fā)揮重要作用。該基因的原核重組表達蛋白在DTT存在的條件