松江鱸(Trachidermus fasciatus)幾種凝集素的基因克隆與功能研究.pdf

1、松江鱸(Trachidermusfasciatus Heckel)隸屬于鮋形目(Scorpaeniformes)，杜父魚科(Cottidae)，松江鱸屬(Trachidermus)。歷史上松江鱸分布較廣，是我國渤海、黃海、東海沿岸及相鄰淡水水域的習見魚類。但自上世紀70年代以來，因為人們的過度捕撈，以及棲息地和繁殖地的嚴重破壞，其種群數(shù)量急劇降低。目前，松江鱸在我國許多水域已絕跡。松江鱸已列為國家二級保護動物。為恢復其自然種群，人工養(yǎng)殖

2、勢在必行。然而養(yǎng)殖過程中多種應激刺激的存在勢必會引起各種疾病的出現(xiàn)和蔓延。只有深入開展松江鱸免疫機制的研究，才可以在人工養(yǎng)殖中采取有效的方法防治疾病，并且為養(yǎng)殖產(chǎn)量的提高提供長遠的管理措施。凝集素通過介導蛋白質(zhì)-碳水化合物的相互作用而成為動物先天免疫的重要組成部分，不僅參與病原體識別過程，同時也負責凝集細菌，固化細菌，激活補體，調(diào)理以及殺菌，甚至能夠調(diào)節(jié)適應性免疫應答過程。面對水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中日益增長的細菌、病毒、真菌以及寄生蟲感染，考慮

3、到各種凝集素不僅能夠快速識別以及從體內(nèi)清除病原菌，而且還能引發(fā)長期有效的適應性免疫，這激發(fā)了我們對松江鱸凝集素免疫作用的研究興趣。本研究從松江鱸體內(nèi)鑒定出三種凝集素(F型，C型，Galectin)和甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)的絲氨酸蛋白酶MASP，并對它們的特性和功能進行了較為全面而系統(tǒng)的研究，得到如下結(jié)果:
　　 1.一種含雙結(jié)構(gòu)域的半乳糖結(jié)合凝集素(Tfgal-9)參與松江鱸對細菌的免疫我們從松江鱸中克隆得到一個galectin-

4、9，命名為TfGal-9。其cDNA全長1453bp，開放閱讀框(ORF)900 bp，編碼299個氨基酸。TfGal-9含有兩個串聯(lián)的糖識別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognition domains，CRDs)，每個結(jié)構(gòu)域均包含2個保守的糖結(jié)合位點H-NPR和WG-EER。熒光實時定量PCR(qRT-PCR)分析表明，半乳糖結(jié)合凝集素廣泛表達于松江鱸各組織，但在腸中表達最為豐富;其次是血、心、腦。LPS刺激后，在檢測的五

5、個組織（血液、皮膚、肝臟、胃和心）中，TfGal-9 mRNA表達均明顯上調(diào)。重金屬刺激后腦TfGal-9表達顯著上調(diào)。利用體外重組表達的TfGal-9蛋白研究其功能，發(fā)現(xiàn)TfGAL-9不依賴鈣離子選擇性凝集和結(jié)合部分細菌。管碟法檢測得知TfGal-9能夠抑制金黃色葡萄球菌(S.aureus)的活性。體外抗氧化實驗表明TfGal-9對DPPH自由基具有清除能力。這些結(jié)果表明TfGal-9參與松江鱸對細菌的先天免疫，并具有抗氧化活性。這是

6、迄今為止首次在魚類對galectin-9的抗菌抗氧化活性進行研究。
　　 2.松江鱸補體的凝集素激活途徑:TfCol-11及MASP的基因克隆與功能研究從松江鱸中鑒定的C-型凝集素collectin-11(TfCol-11)全長CDN序列開放性閱讀框為795 bp，編碼264個氨基酸。它包含三個不同的區(qū)域:(1)含有典型的Gly-X-Y重復序列的膠原樣區(qū)域;(2)頸區(qū);(3)C-末端的CRD結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含保守的可以結(jié)合甘露糖的Gl

7、u-Pro-Asn(EPN)基序。同時我們還克隆得到松江鱸MASP部分cDNA序列(包括96 bp的5'非編碼區(qū)共993 bp)，編碼的氨基酸包含兩個CUB結(jié)構(gòu)域和一個EGF結(jié)構(gòu)域(CUB-EGF-CUB)。RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)TfCol-11和MASP共表達于松江鱸肝臟，LPS刺激會引起二者在皮膚、血液、肝臟和鰓表達明顯上調(diào)，值得注意的是兩基因上調(diào)模式基本一致。利用原核表達系統(tǒng)獲得TfCol-11和MASP重組蛋白。Ca2+存在條件下

8、，TfCol-11可凝集兔紅血細胞及多種細菌，且不依賴于Ca2+結(jié)合多種細菌。在體實驗發(fā)現(xiàn)TfCol-11能夠顯著降低鰻弧菌(Vibrio anguillarum)引起的鯉魚致死率。通過pull-down試驗發(fā)現(xiàn)TfCol-11與MASP可以相互結(jié)合。根據(jù)這些結(jié)果推斷TfCol-11可以激活松江鱸的補體系統(tǒng)，參與對細菌的免疫。
　　 3.松江鱸巖藻糖糖結(jié)合凝集TfFBL的基因克隆與功能研究本研究利用EST（表達序列標簽）和RAC

9、E(cDNA末端快速擴增)技術(shù)從松江鱸中克隆一個F-型凝集素(TfFBL)。TfFBL的cDNA開放性閱讀框為933 bp，可編碼310個氨基酸。TfFBL包含一個信號肽以及緊隨其后的兩個糖識別結(jié)構(gòu)域。每個結(jié)構(gòu)域含保守基序HX26RX5-6R。qRT-PCR分析顯示TfFBL在卵中表達量最大，其次為皮膚、脾臟、腎臟、心臟和鰓。在受到LPS刺激后其表達量在血液、肝臟和皮膚中有明顯的上調(diào)，其中在肝臟、血液，LPS刺激后2 h TfFBL表達