灰葡萄孢除草相關基因的克隆與功能分析.pdf

1、本實驗室利用mRNA差異顯示技術對灰葡萄孢野生菌株BC4和部分誘變菌株(強除草活性菌株和弱除草活性菌株)進行分析，得到一個694 bp的基因片段，該基因可能調控灰葡萄孢除草活性，本研究利用Genomic Walking技術對該基因片段進行擴增，通過兩次5’端Genomic Walking和兩次3’端Genomic Walking，將該基因片段694 bp擴增到3961 bp，在NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對表明，該基因與富克葡萄孢盤菌(

2、Botryotinia　fuckeliana，灰葡萄孢的有性態(tài))中的calcium/calmodulin dependent proteinkinase(CaMK)同源性98％。根據(jù)GenBank報道Botryotinia fuckeliana的完整CDS，從兩端設計引物，利用RT-PCR技術,克隆了BC4的cDNA全長。Southern雜交結果表明該基因在基因組中以單拷貝形式存在。 對CaMK基因進行生物信息學分析，利用DNA

3、MAN軟件將CaMK基因cDNA序列與DNA序列進行比對，發(fā)現(xiàn)BC4菌株的CaMK基因含有7個外顯子和6個內含子。利用DNAStar軟件對CaMK蛋白性質進行預測表明，CaMK預測蛋白的分子量為81.8748 kD，共有730個氨基酸，包括95個強堿性氨基酸(K，R)，116個強酸性氨基酸(D，E)，216個疏水氨基酸(AlLFWV)，160個極性氨基酸(NCQSTY)，等電點(Isoelectric Point)為6.22。利用Sca

4、nPro site軟件分析CaMK一級結構中包含的保守結構域結構特征，發(fā)現(xiàn)CaMK基因一級結構中包含蛋白激酶ATP結合位點和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點。利用SOPMA軟件分析CaMK蛋白的二級結構，用SWISS-MODEl軟件構建CaMK蛋白的三維結構模型。用已獲得的灰葡萄孢CaMK基因5’端開放閱讀框前1330 bp基因組DNA序列在softberry網(wǎng)站中進行啟動子可能功能分析。 構建了重組CaMK質粒，并成功地在Eco

5、li BL2l中得到表達。結果顯示重組的CaMK蛋白大量表達在沉淀中，在上清中沒有表達。研究的結果為蛋白純化和蛋白抗體制備以及進一步研究該基因的功能奠定了基礎。 用CaMK特異性抑制劑KN-62處理灰葡萄孢孢子，結果表明，60μM的KN-62對灰葡萄孢孢子萌發(fā)抑制率為50％，80 μM的KN-62對孢子萌發(fā)抑制率可達98％以上；灰葡萄孢用80μM的KN-62處理后對番茄致病性明顯降低，用80μM KN-62處理后所產毒素的除草活