花鱸IRF3基因表達與功能分析.pdf

1、花鱸（Lateolabrax maculatus）是隸屬于鱸形目（Perciformes）的肉食性的經(jīng)濟魚類，廣泛分布于我國近海水域，在廣鹽、廣溫的環(huán)境下具有生長快和適應(yīng)力強等特點?；|海水養(yǎng)殖規(guī)模的增長，與之伴隨的是各類病毒性和細菌性疾病的不定期無規(guī)律爆發(fā)，除了給養(yǎng)殖業(yè)造成經(jīng)濟和種質(zhì)的損失。而對花鱸免疫基因的研究可以幫助人們在深入了解魚類免疫系統(tǒng)的同時，更進一步認識到魚類當中的免疫應(yīng)答機制。而通過結(jié)合部分特定序列，干擾素調(diào)節(jié)因子和來自

2、干擾素基因或干擾素激活基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)形成聚合物，誘導(dǎo)并調(diào)控干擾素及其信號通路中相關(guān)基因的表達以影響免疫應(yīng)答的作用。本文以花鱸為實驗動物，首先對花鱸脾臟組織結(jié)構(gòu)進行HE染色，接著對花鱸脾臟轉(zhuǎn)錄組進行生物信息學(xué)分析，從中篩選出與花鱸非特異性免疫相關(guān)的基因，并對篩選得到的部分免疫相關(guān)基因進行表達和功能分析，主要包括如下三個方面的研究內(nèi)容。
　　花鱸脾臟石蠟切片HE染色結(jié)果顯示：被膜外包在花鱸脾臟的表面，脾臟組織結(jié)構(gòu)含有分界不清晰的紅髓

3、和白髓，除了在脾臟組織間隙分布大量血管、淋巴細胞和血細胞外，花鱸脾臟的血管附近還有黑色素巨噬細胞中心。這些結(jié)果表明花鱸脾臟可能參與魚類的免疫和造血等方面的功能。
　　對花鱸脾臟轉(zhuǎn)錄組的高通量測序，得到3.73GB的clean data，花鱸脾臟總unigenes為25380條，Q20為92.27％，Q30為87.66%，GC含量為52.60%。并分別對花鱸脾臟轉(zhuǎn)錄組進行eggNOG Group分析、GO注釋和KEGG通路分析：eg

4、gNOG Group結(jié)果顯示功能主要注釋到Signal transduction mechanisms信號傳導(dǎo)機制（5317個，21.15%），而注釋到轉(zhuǎn)錄Transcription、防御機制Defense mechanisms和RNA加工修飾（RNA processing and modification）的基因分別為2487、216和690個；GO功能注釋到三大類，分別是分子功能（molecular function）、細胞位置（c

5、e llular co mpo ne nt）、生物過程（biolo gica l pro cess），以分子功能的注釋次數(shù)最高（48.11%，49629次），在注釋到‘生物過程’的當中注釋次數(shù)最多的是biological_process，達到7234，占7.01%，而注釋到‘immune system process’次數(shù)有603次；KEGG代謝通路注釋結(jié)果表明，有17220條基因能在K EGG數(shù)據(jù)庫得到注釋，其中富集到Environm

6、ental Information Processing的Signal transduction通路上的基因數(shù)目最多，注釋到‘signal transduction’通路的共有2158個基因，占總Unigene的12.53%，注釋在‘immune system’通路下花鱸脾臟內(nèi)有15種免疫相關(guān)的信號通路，包括Toll樣受體信號通路等信號通路，在這當中，Chemokine signaling pathway、Platelet activa

7、tion和Tcell receptor signaling pathway的表達量最高。目前在花鱸轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)當中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的IRF家族包括IRF1-IRF9。
　　本研究通過克隆首次得到花鱸干擾素調(diào)節(jié)因子1、2和3的序列，已獲得花鱸IRF1和IRF2的開放性閱讀框分別為899 bp和1007 bp，對應(yīng)編碼的氨基酸數(shù)分別是292個和328個，將通過構(gòu)建的IRF1-pFLAG-CMV、IRF2-pFLAG-CMV和IRF3-pFL

8、AG-CMV報告基因載體進行表達分析。本實驗克隆了得到花鱸IRF3的cDNA全長1781 bp，根據(jù)1398 bp的開放閱讀框推測的編碼465個氨基酸蛋白。氨基酸比對結(jié)果顯示：花鱸IRF3和脊椎動物IRF3同源蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上具有相似的保守性，如相同的DNA結(jié)合域、IRF關(guān)聯(lián)域、絲氨酸富集的C-末端結(jié)構(gòu)域和色氨酸殘基簇。系統(tǒng)進化分析表明，花鱸IRF3隸屬于IRF3家族。通過qRT-PCR對比經(jīng)過poly I:C或PBS處理的花鱸各種組織中

9、的SpIRF3 mRNA差異表達，發(fā)現(xiàn)SpIRF3主要集中分布在腦、鰓、肝、脾和頭腎中表達。經(jīng)過po ly I:C處理后，花鱸五個組織特別是頭腎和脾臟的IRF3轉(zhuǎn)錄表達成倍上調(diào)。FITC-anti-FLAG標記的IRF3的熒光圖像的亞細胞定位分析表明，花鱸IRF3在未受到刺激時主要分布在細胞質(zhì)中，但是經(jīng)過Poly I:C處理后花鱸IRF3出現(xiàn)往細胞核中遷移聚集，Western blot實驗結(jié)果也驗證了以上結(jié)果。同時Western blo