PI3K-Akt-mTOR信號通路在肝細胞癌發(fā)病機制中的作用及靶向干預(yù)研究.pdf

1、目的:通過特異性阻斷PI3K和mTOR,觀察HepG2和Hep3B細胞株P(guān)I3K/Akt/mTOR信號通路活性及生物學(xué)行為的改變,探討相關(guān)的分子機制。
　　 方法:在培養(yǎng)的HepG2、Hep3B人肝癌細胞株和人正常肝細胞株QSG-7701上,以免疫印跡方法(Western blot)檢測各細胞株中PI3K(p110α亞單位)、PTEN、pAkt(S473,T308)和p-mTOR(S2448)的表達情況；分別用PI3K抑制劑LY

2、294002(50μmol/ml)和mTOR抑制劑Rapamycin(RAPA,50 nmol/ml)孵育HepG2和Hep3B細胞,以MTT比色法檢測細胞的增殖能力,以流式細胞術(shù)(Flow cytometry)檢測細胞周期和凋亡情況,以Western blot法檢測細胞中pAkt(S473,T308)和p-mTOR(S2448)的表達改變。
　　 結(jié)果:PTEN在HepG2和Hep3B細胞中基本無表達,在QSG-7701細胞株

3、中高表達,pAkt和p-mTOR在HepG2和Hep3B細胞中的表達較QSG-7701細胞均顯著升高；LY294002和RAPA均呈劑量-時間依賴的抑制HepG2和Hep3B細胞生長。飽和效應(yīng)濃度的LY294002和RAPA作用24小時后,HepG2和Hep3B細胞均呈現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯,處于S期的細胞比例較對照組顯著減少(P<0.01)；兩給藥組中HepG2細胞和Hep3B細胞的凋亡率與對照組比較均顯著增加(P<0.01)；兩給

4、藥組HepG2細胞的凋亡率顯著高于Hep3B細胞(P<0.01或P<0.05),并且HepG2細胞的凋亡率在RAPA給藥組顯著高于LY294002給藥組(P<0.01),但Hep3B細胞的凋亡率在兩組間無顯著差異。飽和效應(yīng)濃度的LY294002作用48小時后,HepG2和Hep3B細胞中pAkt(T308,S473)和p-mTOR(S2448)的表達水平較對照組均顯著降低(P<0.01),飽和效應(yīng)濃度的RAPA作用48小時后,HepG2

5、和Hep3B細胞中P—mTOR(S2448)的表達水平較對照組均顯著降低(P<0.01),而pAkt(T308,S473)的表達水平較對照組均顯著升高(分別P<0.01)。
　　 結(jié)論:(1)HepG2和Hep3B細胞存在PI3K/Akt/mTOR信號通路的組成性激活；(2)LY294002和RAPA能有效阻斷HepG2和Hep3B細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路,抑制HCC細胞的生長增殖,誘導(dǎo)細胞周期阻滯,促進細胞凋亡,

6、且阻斷效應(yīng)與HCC細胞P53的表達有關(guān);(3)一定濃度范圍內(nèi),HepG2細胞對PI3K/Akt/mTOR信號通路阻斷劑的敏感性高于Hep3B細胞,RAPA對PI3K/Akt/mTOR信號通路的部分阻斷效應(yīng)優(yōu)于LY294002。
　　 目的:觀察阿霉素(Doxorubicin,DOX)單用或與RAPA聯(lián)合用藥對HepG2和Hep3B細胞生物學(xué)行為及PI3K/Akt/mTOR信號通路活性的影響,探討mTOR抑制劑增強HCC化療藥物療

7、效的相關(guān)作用機制。
　　 方法:分別取對數(shù)生長期的HepG2和Hep3B細胞,以不同濃度的DOX單用或與RAPA(20 nmol/ml)聯(lián)合應(yīng)用培養(yǎng)48h或24h,以MTT法測定藥物對HepG2和Hep3B細胞的增殖抑制作用,以流式細胞技術(shù)檢測二者的凋亡情況,以Western blot法檢測者P—p70S6K(T389)、P-4E-BP1(S65)和pS6(S235/236)的表達改變。
　　 結(jié)果:0.156～2.5

8、mg/L濃度范圍內(nèi),DOX能抑制HepG2和Hep3B細胞的增殖,且呈濃度依賴性；DOX在0.625～10mg/L濃度范圍內(nèi),Hep3B細胞的相對存活率顯著大于HepG2細胞(P<0.01)；與DOX單用比較,DOX(0.156～2.5mg/L)與RAPA聯(lián)用顯著降低了HepG2和Hep3B細胞的存活率(P<0.01或P<0.05),DOX(0.156～10mg/L)與RAPA聯(lián)用,Hep3B細胞存活率顯著大于HepG2細胞(P<0.0

9、1)。DOX(0.156～10mg/L)單用或與RAPA聯(lián)用24h均可誘導(dǎo)HepG2和Hep3B細胞凋亡發(fā)生,且隨DOX濃度增加,凋亡牢升高;與DOX單用比較,DOX(1.25～10mg/L)與RAPA聯(lián)用,HepG2細胞捌亡率較顯著升高(P<0.01或P<0.05),DOX(2.5～10 mg/L)與RAPA聯(lián)用,Hep3B細胞凋亡率顯著升高(分別P<0.05)；DOX(5.0～10mg/L)單用,HepG2細胞凋亡率顯著大于Hep3

10、B細胞(分別P<0.05),DOX(2.5～10 mg/L)與RAPA聯(lián)用,HepG2細胞凋亡率顯著大于Hep3B細胞(分別P<0.01)。RAPA(20nmol/L)、DOX(2.5mg/L)以及二者聯(lián)用均可導(dǎo)致HepG2或Hep3B細胞P-p70S6K(T389)、P-4E-BP1(S65)和pS6(S235/236)表達減少,且以DOX與RAPA聯(lián)用效應(yīng)最為明顯。
　　 結(jié)論:(1)DOX可抑制HepG2和Hep3B細胞生

11、長增殖,促進細胞凋亡,下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化程度；(2)DOX與RAPA聯(lián)合用藥能顯著抑制HepG2和Hep3B細胞的增殖,促進細胞凋亡,下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化程度,并在一定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)；(3)在一定濃度范圍內(nèi),HepG2細胞對DOX單用或與RAPA聯(lián)合用藥的敏感性顯著高于Hep3B細胞,可能與HCC細胞p53的表達差異有關(guān)。
　　 目的:分析人HCC組織中PI3K/Akt

12、/mTOR信號通路的活化水平與p53的表達及HCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,評估PI3K/Akt/mTOR信號通路在HCC診斷和預(yù)后評價中的作用。
　　 方法:76例HCC組織樣本經(jīng)臨床病理分期分級后,以免疫組織化學(xué)方法檢測HCC組織和癌旁組織中p53、pAkt、PTEN、p-mTOR和pS6的表達情況,分析上述指標(biāo)在不同HCC病理特征條件下的陽性表達率,并與正常肝組織比較。
　　 結(jié)果:p53、pAkt、PTEN、p-m

13、TOR和pS6在人HCC組織有不同程度的表達,HCC組織p53(60.5％,46/76)、pAkt(92.1％,70/76)、p-mTOR(84.2％,64/76)和pS6(88.2％,67/76)的陽性表達比例較癌旁肝組織(分別為10.5％,8/76、63.2％,48/76、46.1％,35/76、52.6％,40/76)和正常肝組織(分別為0％、55.0％,11/20、50.0％,10/20、45.0％,9/20)顯著升高(P<0.

14、01),而PTEN(65.8％,50/76)的陽性表達比例較癌旁肝組織(89.5％,68/76)和正常肝組織(85.0％,17/20)顯著減少(P<0.05)；p53陽性表達HCC組織pAkt、p-mTOR和pS6的陽性表達率較p53陰性表達組織顯著升高(P<0.01),而PTEN的陽性表達率較p53陰性表達組織顯著降低(P＜0.01)。低分化、存在血管侵襲、TNM分期高的HCC組織p53、pAkt、p-mTOR和pS6的陽性表達率較相

15、對應(yīng)的分化較好、無血管侵襲、TNM分期低的HCC組織顯著升高(分別P<0.01或P<0.05)；而PTEN的陽性表達率顯著降低(分別P<0.01或P<0.05)。
　　 結(jié)論:(1)人HCC組織存在PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活；(2)人HCC組織PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化程度與p53的表達可能有相關(guān)性；(3)人HCC組織PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化程度與HCC的臨床病理特征有關(guān),活化程度越高