PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路在肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制中的作用及靶向干預(yù)研究.pdf

1、目的:通過(guò)特異性阻斷PI3K和mTOR,觀察HepG2和Hep3B細(xì)胞株P(guān)I3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活性及生物學(xué)行為的改變,探討相關(guān)的分子機(jī)制。
　　 方法:在培養(yǎng)的HepG2、Hep3B人肝癌細(xì)胞株和人正常肝細(xì)胞株QSG-7701上,以免疫印跡方法(Western blot)檢測(cè)各細(xì)胞株中PI3K(p110α亞單位)、PTEN、pAkt(S473,T308)和p-mTOR(S2448)的表達(dá)情況；分別用PI3K抑制劑LY

2、294002(50μmol/ml)和mTOR抑制劑Rapamycin(RAPA,50 nmol/ml)孵育HepG2和Hep3B細(xì)胞,以MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力,以流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況,以Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中pAkt(S473,T308)和p-mTOR(S2448)的表達(dá)改變。
　　 結(jié)果:PTEN在HepG2和Hep3B細(xì)胞中基本無(wú)表達(dá),在QSG-7701細(xì)胞株

3、中高表達(dá),pAkt和p-mTOR在HepG2和Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)較QSG-7701細(xì)胞均顯著升高；LY294002和RAPA均呈劑量-時(shí)間依賴(lài)的抑制HepG2和Hep3B細(xì)胞生長(zhǎng)。飽和效應(yīng)濃度的LY294002和RAPA作用24小時(shí)后,HepG2和Hep3B細(xì)胞均呈現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯,處于S期的細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著減少(P<0.01)；兩給藥組中HepG2細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組比較均顯著增加(P<0.01)；兩給

4、藥組HepG2細(xì)胞的凋亡率顯著高于Hep3B細(xì)胞(P<0.01或P<0.05),并且HepG2細(xì)胞的凋亡率在RAPA給藥組顯著高于LY294002給藥組(P<0.01),但Hep3B細(xì)胞的凋亡率在兩組間無(wú)顯著差異。飽和效應(yīng)濃度的LY294002作用48小時(shí)后,HepG2和Hep3B細(xì)胞中pAkt(T308,S473)和p-mTOR(S2448)的表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著降低(P<0.01),飽和效應(yīng)濃度的RAPA作用48小時(shí)后,HepG2

5、和Hep3B細(xì)胞中P—mTOR(S2448)的表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著降低(P<0.01),而pAkt(T308,S473)的表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著升高(分別P<0.01)。
　　 結(jié)論:(1)HepG2和Hep3B細(xì)胞存在PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的組成性激活；(2)LY294002和RAPA能有效阻斷HepG2和Hep3B細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路,抑制HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,

6、且阻斷效應(yīng)與HCC細(xì)胞P53的表達(dá)有關(guān);(3)一定濃度范圍內(nèi),HepG2細(xì)胞對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路阻斷劑的敏感性高于Hep3B細(xì)胞,RAPA對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的部分阻斷效應(yīng)優(yōu)于LY294002。
　　 目的:觀察阿霉素(Doxorubicin,DOX)單用或與RAPA聯(lián)合用藥對(duì)HepG2和Hep3B細(xì)胞生物學(xué)行為及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活性的影響,探討mTOR抑制劑增強(qiáng)HCC化療藥物療

7、效的相關(guān)作用機(jī)制。
　　 方法:分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和Hep3B細(xì)胞,以不同濃度的DOX單用或與RAPA(20 nmol/ml)聯(lián)合應(yīng)用培養(yǎng)48h或24h,以MTT法測(cè)定藥物對(duì)HepG2和Hep3B細(xì)胞的增殖抑制作用,以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)二者的凋亡情況,以Western blot法檢測(cè)者P—p70S6K(T389)、P-4E-BP1(S65)和pS6(S235/236)的表達(dá)改變。
　　 結(jié)果:0.156～2.5

8、mg/L濃度范圍內(nèi),DOX能抑制HepG2和Hep3B細(xì)胞的增殖,且呈濃度依賴(lài)性；DOX在0.625～10mg/L濃度范圍內(nèi),Hep3B細(xì)胞的相對(duì)存活率顯著大于HepG2細(xì)胞(P<0.01)；與DOX單用比較,DOX(0.156～2.5mg/L)與RAPA聯(lián)用顯著降低了HepG2和Hep3B細(xì)胞的存活率(P<0.01或P<0.05),DOX(0.156～10mg/L)與RAPA聯(lián)用,Hep3B細(xì)胞存活率顯著大于HepG2細(xì)胞(P<0.0

9、1)。DOX(0.156～10mg/L)單用或與RAPA聯(lián)用24h均可誘導(dǎo)HepG2和Hep3B細(xì)胞凋亡發(fā)生,且隨DOX濃度增加,凋亡牢升高;與DOX單用比較,DOX(1.25～10mg/L)與RAPA聯(lián)用,HepG2細(xì)胞捌亡率較顯著升高(P<0.01或P<0.05),DOX(2.5～10 mg/L)與RAPA聯(lián)用,Hep3B細(xì)胞凋亡率顯著升高(分別P<0.05)；DOX(5.0～10mg/L)單用,HepG2細(xì)胞凋亡率顯著大于Hep3

10、B細(xì)胞(分別P<0.05),DOX(2.5～10 mg/L)與RAPA聯(lián)用,HepG2細(xì)胞凋亡率顯著大于Hep3B細(xì)胞(分別P<0.01)。RAPA(20nmol/L)、DOX(2.5mg/L)以及二者聯(lián)用均可導(dǎo)致HepG2或Hep3B細(xì)胞P-p70S6K(T389)、P-4E-BP1(S65)和pS6(S235/236)表達(dá)減少,且以DOX與RAPA聯(lián)用效應(yīng)最為明顯。
　　 結(jié)論:(1)DOX可抑制HepG2和Hep3B細(xì)胞生

11、長(zhǎng)增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的活化程度；(2)DOX與RAPA聯(lián)合用藥能顯著抑制HepG2和Hep3B細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的活化程度,并在一定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)；(3)在一定濃度范圍內(nèi),HepG2細(xì)胞對(duì)DOX單用或與RAPA聯(lián)合用藥的敏感性顯著高于Hep3B細(xì)胞,可能與HCC細(xì)胞p53的表達(dá)差異有關(guān)。
　　 目的:分析人HCC組織中PI3K/Akt

12、/mTOR信號(hào)通路的活化水平與p53的表達(dá)及HCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,評(píng)估PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在HCC診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)中的作用。
　　 方法:76例HCC組織樣本經(jīng)臨床病理分期分級(jí)后,以免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HCC組織和癌旁組織中p53、pAkt、PTEN、p-mTOR和pS6的表達(dá)情況,分析上述指標(biāo)在不同HCC病理特征條件下的陽(yáng)性表達(dá)率,并與正常肝組織比較。
　　 結(jié)果:p53、pAkt、PTEN、p-m

13、TOR和pS6在人HCC組織有不同程度的表達(dá),HCC組織p53(60.5％,46/76)、pAkt(92.1％,70/76)、p-mTOR(84.2％,64/76)和pS6(88.2％,67/76)的陽(yáng)性表達(dá)比例較癌旁肝組織(分別為10.5％,8/76、63.2％,48/76、46.1％,35/76、52.6％,40/76)和正常肝組織(分別為0％、55.0％,11/20、50.0％,10/20、45.0％,9/20)顯著升高(P<0.

14、01),而PTEN(65.8％,50/76)的陽(yáng)性表達(dá)比例較癌旁肝組織(89.5％,68/76)和正常肝組織(85.0％,17/20)顯著減少(P<0.05)；p53陽(yáng)性表達(dá)HCC組織pAkt、p-mTOR和pS6的陽(yáng)性表達(dá)率較p53陰性表達(dá)組織顯著升高(P<0.01),而PTEN的陽(yáng)性表達(dá)率較p53陰性表達(dá)組織顯著降低(P＜0.01)。低分化、存在血管侵襲、TNM分期高的HCC組織p53、pAkt、p-mTOR和pS6的陽(yáng)性表達(dá)率較相

15、對(duì)應(yīng)的分化較好、無(wú)血管侵襲、TNM分期低的HCC組織顯著升高(分別P<0.01或P<0.05)；而PTEN的陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低(分別P<0.01或P<0.05)。
　　 結(jié)論:(1)人HCC組織存在PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活；(2)人HCC組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的活化程度與p53的表達(dá)可能有相關(guān)性；(3)人HCC組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的活化程度與HCC的臨床病理特征有關(guān),活化程度越高