基于PI3K-Akt-mTOR信號通路研究丹參酮IIA對腦梗死后的神經(jīng)保護調(diào)控機制.pdf

1、研究背景：腦梗死是腦血管病中最常見的疾病及主要致殘原因之一，目前除超早期溶栓外尚缺乏有效治療手段。目前治療腦梗死的策略主要分為兩個：再灌注和神經(jīng)保護。臨床溶栓治療時間窗只有3-4.5h，且有顱內(nèi)出血風險，極大的限制了其在臨床上的應用，因此，盡早將“再灌注”與“神經(jīng)保護”相結(jié)合才是最佳的治療方法。已有研究表明腦梗死后自噬過度激活可導致細胞死亡，然而其自噬過度激活機制目前仍不清楚，有待進一步闡明。PI3K/Akt/mTOR信號通路是調(diào)節(jié)細胞

2、增殖、生長、分化、生存的重要通路，同時又是調(diào)節(jié)自噬的上游通路。既往研究發(fā)現(xiàn)腦梗死后伴自噬上游信號通路PI3K/Akt的抑制，而丹參酮IIA可激活PI3K/Akt，但丹參酮IIA能否因此而抑制其下游自噬尚需進一步研究。所以基于PI3K/Akt/mTOR信號通路探討腦梗死后自噬過度激活機制及丹參酮IIA對腦梗死后自噬的調(diào)控機制，可望為腦梗死臨床治療提供實驗依據(jù)和新思路，為中醫(yī)藥防治腦梗死提供新方法。
　　目的：基于PI3K/Akt/m

3、TOR信號通路探討腦梗死后自噬過度激活機制及丹參酮IIA對腦梗死后自噬的調(diào)控機制。
　　方法首先進行鼠海馬細胞株的培養(yǎng)，進而構(gòu)建鼠海馬神經(jīng)細胞OGD模型。觀察普通培養(yǎng)以及缺氧缺糖培養(yǎng)后細胞的增殖變化，研究腦梗塞后對細胞的增殖影響；使用不同濃度的丹參酮IIA處理OGD模型中的神經(jīng)細胞，研究丹參酮IIA對于細胞的神經(jīng)保護作用（包括細胞增殖，氧化損傷，線粒體膜通透性，自噬作用）；基于PI3K/Akt/mTOR通路后使用不同濃度丹參酮II

4、A處理OGD中的細胞，研究基于該通路的神經(jīng)保護作用。
　　結(jié)果：1：與普通培養(yǎng)比較后，OGD6/R6模型中細胞有50%以上死亡，但丹參酮IIA處理該細胞后有顯著抑制細胞死亡，表明丹參酮IIA有抑制細胞死亡，保護細胞的作用；
　　2：（1）丹參酮IIA可以促進神經(jīng)細胞增殖發(fā)揮神經(jīng)保護作用；
　　（2）用CM-H2DCFDA標記細胞內(nèi)氧化應激過程（綠色熒光）顯示丹參酮IIA可以抑制細胞活性氧產(chǎn)生發(fā)揮神經(jīng)保護作用；
　

5、　（3）活性氧的產(chǎn)生會損傷線粒體膜以及影響膜電位的改變，用JC-1標記膜電位改變（靜息電位為紅色、綠色為動作電位）顯示丹參酮IIA可以抑制線粒體膜電位的改變產(chǎn)生神經(jīng)保護作用；
　?。?）丹參酮IIA可以有效減少自噬蛋白LC3II的產(chǎn)生，丹參酮IIA通過增加上游P85、Akt、mTOR來抑制自噬蛋白的表保達發(fā)揮神經(jīng)護作用；
　　3：（1）丹參酮IIA可以促進神經(jīng)細胞增殖發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但使用mTOR siRNAs、Akt s

6、iRNAs、LY294002（PI3K抑制劑）處理HT-22神經(jīng)細胞后，丹參酮IIA未表現(xiàn)出相關(guān)神經(jīng)保護作用
　?。?）丹參酮IIA可以抑制活性氧產(chǎn)生發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但使用mTOR siRNAs、Akt siRNAs、LY294002（PI3K抑制劑）處理HT-22神經(jīng)細胞后，丹參酮IIA未表現(xiàn)出相關(guān)神經(jīng)保護作用；
　?。?）丹參酮IIA可以穩(wěn)定線粒體膜電位穩(wěn)定發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但使用mTOR siRNAs、Akt siR

7、NAs、LY294002（PI3K抑制劑）處理HT-22神經(jīng)細胞后，丹參酮IIA未表現(xiàn)出相關(guān)神經(jīng)保護作用；
　?。?）丹參酮IIA可以有效減少自噬蛋白LC3II的產(chǎn)生，但使用mTOR siRNAs、Akt siRNAs、LY294002（PI3K抑制劑）處理HT-22神經(jīng)細胞后，丹參酮 IIA未有減少 LC3II的表達；丹參酮 IIA可以激活 pp85, p-akt and p-mTOR，減少LC3II的表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用。