活化蛋白C抑制足細胞凋亡的作用與機制研究.pdf

1、目的：①研究aPC對PAN誘導的足細胞凋亡的影響。㈡探索aPC抗足細胞凋亡的作用機制。③探討aPC和PAR-3下游信號通路在抗足細胞凋亡中的可能作用。
　　 方法：⑴用TUNEL凋亡試劑盒檢測不同濃度aPC對PAN誘導的人足細胞凋亡的影響,同時在封閉抗體及Aptamer的干預下檢測aPC抗凝血作用對足細胞凋亡的影響。⑵應用RT-PCR，Western Blot,免疫熒光技術(shù)對足細胞相關(guān)基因(Thbd,PAR-1,PAR-2,PA

2、R-3,PAR-4,EPCR)表達譜及蛋白質(zhì)表達譜進行分析。⑶運用相關(guān)受體特異激動劑及封閉抗體進行干預，篩選出參與aPC影響足細胞凋亡關(guān)鍵受體，進一步運用shRNAmir gene Knock Down技術(shù)證實篩選關(guān)鍵受體的正確性。⑷在不同刺激下(aPC,TRAP-3,Thrombin)，用熒光顯微鏡持續(xù)記錄鈣敏感的熒光染料（Fura-2 AM)標記的足細胞，檢測細胞內(nèi)鈣離子的變化。⑸借助免疫共沉淀技術(shù)研究相關(guān)受體作用的時效性。⑹采用分

3、子生物學技術(shù)構(gòu)建表達V5指示蛋白標記的野生型PAR-3載體，用定點突變試劑盒構(gòu)建PAR-3相關(guān)突變型載體并用其轉(zhuǎn)染腎小球系膜細胞系，建立相應穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系檢測aPC和PAR-3的相互作用以及對凋亡的影響。⑺運用Western Blot，免疫共沉淀技術(shù)針對可能會參與aPC對凋亡調(diào)控的信號通路Caveolae，RhoA及ERK1/2等進行相關(guān)活性檢測。
　　 結(jié)果：①aPC顯著降低了PAN誘導的足細胞的凋亡，即使在0.2nM這樣低的

4、濃度仍具有顯著的保護作用，此外利用封閉抗體HAAPC及Aptamer HSO2-88阻斷aPC的抗凝功能對上述實驗結(jié)果無顯著性影響。②體外培養(yǎng)的人足細胞在基因轉(zhuǎn)錄層面極強表達PAR-2，PAR-3及Thbd，而PAR-1和PAR-4表達量極低，更有趣的是EPCR表達缺失，Western Blot數(shù)據(jù)從其翻譯的蛋白質(zhì)層面進一步證實了上述結(jié)果。此外健康人腎臟活檢冰凍切片雙標免疫熒光檢測確證了在體足細胞表達PAR-2，PAR-3而無EPCR表

5、達。③從對PAR-1,PAR-2,PAR-3,PAR-4特異激動劑及封閉抗體的研究中發(fā)現(xiàn)PAR-2及PAR-3是參與aPC影響足細胞凋亡關(guān)鍵受體，對采用shRNAmir gene Knock Down技術(shù)分別建立PAR-2及PAR-3Knock Down的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的研究中進一步肯定了PAR-2及PAR-3是參與aPC影響足細胞凋亡關(guān)鍵受體。④在對足細胞胞內(nèi)鈣離子監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)aPC及PAR-3激動劑無法誘導胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，只有對照組

6、在Thrombin的誘導下于刺激后80秒左右產(chǎn)生一胞內(nèi)鈣離子峰值。⑤免疫共沉淀結(jié)果顯示PAR-2和PAR-3在aPC的刺激下形成異二聚體并呈時間依賴性，其聚合在刺激后10分鐘時開始增加，然后隨時間不斷增加。在PAR-3封閉抗體的干預下PAR-2和PAR-3在aPC的刺激下無法形成異二聚體。⑥RT-PCR結(jié)果顯示PAR-2，PAR-3及其突變載體轉(zhuǎn)染成功。aPC結(jié)合實驗結(jié)果表明，PAR-3及其突變體均可以同aPC結(jié)合。在對aPC刺激后收集

7、的細胞上清液的Western Blot分析過程中發(fā)現(xiàn)，在野生型和胞外段加TEM1穿膜及胞內(nèi)段的突變載體穩(wěn)轉(zhuǎn)的細胞系上清中能檢測到V5指示蛋白，而在cleavage site突變載體穩(wěn)轉(zhuǎn)的細胞系上清中沒能檢測到V5指示蛋白。轉(zhuǎn)染PAR-3野生型或其突變型載體的研究中發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜細胞只有轉(zhuǎn)染PAR-3野生型載體才能在aPC的刺激下對抗staurosporine或高濃度葡萄糖誘導的凋亡。⑦免疫共沉淀結(jié)果顯示aPC刺激下調(diào)了Caveolin

8、-1和PAR-2及PAR-3的結(jié)合，在用M(β)CD破壞Caveolea 結(jié)構(gòu)后aPC失去其調(diào)節(jié)作用。Western Blot結(jié)果顯示磷酸化的Caveolin-1 同總的Caveolin-1的比值隨aPC的刺激時間增加而逐漸降低。此外aPC和PAR-2 激動劑均無法抑制PAN誘導的Cavolin-1 gene Knock Down 穩(wěn)轉(zhuǎn)足細胞的凋亡。抑制Gαi，EGFR及 sphingosine receptor-1的活化對aPC的抗凋

9、亡作用無影響,然而抑制RhoA及MEK1 /MEK2的活化卻讓aPC抗凋亡作用消失。ERK1/2磷酸化及RhoA的活化均在aPC刺激10分鐘后顯著升高與Caveolin-1的去磷酸化過程一致。
　　 結(jié)論：⑴aPC有效降低PAN誘導的足細胞凋亡并獨立于其抗凝血功能。⑵人足細胞表達PAR-2和PAR-3，aPC能結(jié)合并裂解PAR-3，PAR-2和PAR-3及其異二聚體形成在aPC抗凋亡的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。⑶aPC抗凋亡作用需要Ca