線粒體功能障礙在高糖刺激的小鼠足細胞凋亡中的作用機制研究.pdf

1、目的：觀察高糖培養(yǎng)的小鼠腎臟足細胞中凋亡發(fā)生的情況，探討傳統(tǒng)線粒體凋亡途徑在糖尿病小鼠腎臟足細胞凋亡發(fā)生中的可能作用，以便更深入的了解糖尿病(diabetes mellitus，DM)腎損傷的潛在分子機制。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病臨床常見且有嚴重并發(fā)癥之一，在其發(fā)展過程中，腎臟固有細胞過度凋亡導致的細胞增殖與凋亡關系的不平衡是腎功能惡化甚至衰竭的重要機制之一。腎小囊內層上皮細胞，即足細胞是高度

2、特異、終末分化的上皮細胞，是腎小球濾過屏障的重要成分，在腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，從足細胞角度重新認識腎臟疾病逐漸成為研究熱點。細胞凋亡是足細胞損傷表型改變的主要特征之一，與多種信號通路密切相關。細胞凋亡又稱程序性死亡，廣泛存在于細胞生物的各種組織中，死亡受體途徑和線粒體損傷途徑是兩條經(jīng)典凋亡途徑，其中線粒體是細胞進行呼吸作用的細胞器，是細胞能量代謝的中心，具有通過氧化磷酸化合成ATP產(chǎn)生能量的重要功能，多種因素如：缺血、缺氧

3、、氧化應激產(chǎn)物堆積等均可干擾線粒體功能，促進線粒體膜通透性增加，線粒體跨膜電位難以維持，細胞色素C(Cytochrome C，Cyt-c)釋放，引發(fā)caspase級聯(lián)反應，最終活化蛋白水解酶caspase-3，導致細胞凋亡。本實驗模擬糖尿病的體外環(huán)境，觀察體外培養(yǎng)的小鼠足細胞的凋亡情況，并通過檢測線粒體膜電位以及相關凋亡因子caspase-3、Cyt-c的表達變化，探討線粒體功能障礙在高糖刺激的小鼠足細胞凋亡中的作用。
　　方法：

4、常規(guī)培養(yǎng)小鼠足細胞(mouse podocyte，PC)，將分化成熟的足細胞經(jīng)無血清培養(yǎng)基同步化12h后分為分成2組：正常糖對照組(NG)：D-葡萄糖1g/L：高糖刺激組(HG)：D-葡萄糖4.5g/L，于刺激24、48、72h后收集細胞及蛋白，透射電鏡觀察細胞超微結構改變；TUNEL法及流式細胞術檢測細胞凋亡；流式細胞術檢測線粒體跨膜電位；免疫細胞化學和Western blot檢測足細胞中Caspase-3蛋白的表達變化；Wester

5、n blot檢測Cytochrome C蛋白的表達變化。
　　結果：⑴透射電鏡結果顯示，正常足細胞結構清晰，可見少許微絨毛、細小突起。高糖刺激下，足細胞絨毛及突起增多，細胞內可見大量空泡，線粒體形態(tài)無明顯改變；⑵流式細胞術及TUNEL法結果均顯示：高糖刺激組細胞凋亡數(shù)明顯高于對照組；⑶高糖刺激組較正常對照組足細胞線粒體膜電位(mitochondrialtranmembrane pitentials，△ψm)明顯下降；⑷免疫組化結果

6、：對照組足細胞Caspase-3有少量陽性表達，高糖刺激后，細胞內Caspase-3蛋白表達明顯增強；⑸Western blot結果：高糖刺激組Cytochrome C、Caspase-3表達較正常對照組增高。
　　結論：高糖刺激的足細胞線粒體膜電位明顯下降，釋放到胞質中的Cyt-c增高，Caspase-3表達上調，提示高糖刺激引起了足細胞中線粒體功能障礙，其相關凋亡途徑可能參與了足細胞的凋亡過程，并在DN的發(fā)生和發(fā)展中起著關鍵作