線粒體功能障礙在高糖刺激的小鼠足細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察高糖培養(yǎng)的小鼠腎臟足細(xì)胞中凋亡發(fā)生的情況，探討傳統(tǒng)線粒體凋亡途徑在糖尿病小鼠腎臟足細(xì)胞凋亡發(fā)生中的可能作用，以便更深入的了解糖尿病(diabetes mellitus，DM)腎損傷的潛在分子機(jī)制。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病臨床常見(jiàn)且有嚴(yán)重并發(fā)癥之一，在其發(fā)展過(guò)程中，腎臟固有細(xì)胞過(guò)度凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞增殖與凋亡關(guān)系的不平衡是腎功能惡化甚至衰竭的重要機(jī)制之一。腎小囊內(nèi)層上皮細(xì)胞，即足細(xì)胞是高度

2、特異、終末分化的上皮細(xì)胞，是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要成分，在腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，從足細(xì)胞角度重新認(rèn)識(shí)腎臟疾病逐漸成為研究熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡是足細(xì)胞損傷表型改變的主要特征之一，與多種信號(hào)通路密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡，廣泛存在于細(xì)胞生物的各種組織中，死亡受體途徑和線粒體損傷途徑是兩條經(jīng)典凋亡途徑，其中線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的細(xì)胞器，是細(xì)胞能量代謝的中心，具有通過(guò)氧化磷酸化合成ATP產(chǎn)生能量的重要功能，多種因素如：缺血、缺氧

3、、氧化應(yīng)激產(chǎn)物堆積等均可干擾線粒體功能，促進(jìn)線粒體膜通透性增加，線粒體跨膜電位難以維持，細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt-c)釋放，引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終活化蛋白水解酶caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M糖尿病的體外環(huán)境，觀察體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞的凋亡情況，并通過(guò)檢測(cè)線粒體膜電位以及相關(guān)凋亡因子caspase-3、Cyt-c的表達(dá)變化，探討線粒體功能障礙在高糖刺激的小鼠足細(xì)胞凋亡中的作用。
　　方法：

4、常規(guī)培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞(mouse podocyte，PC)，將分化成熟的足細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12h后分為分成2組：正常糖對(duì)照組(NG)：D-葡萄糖1g/L：高糖刺激組(HG)：D-葡萄糖4.5g/L，于刺激24、48、72h后收集細(xì)胞及蛋白，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；TUNEL法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體跨膜電位；免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測(cè)足細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)變化；Wester

5、n blot檢測(cè)Cytochrome C蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：⑴透射電鏡結(jié)果顯示，正常足細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)少許微絨毛、細(xì)小突起。高糖刺激下，足細(xì)胞絨毛及突起增多，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量空泡，線粒體形態(tài)無(wú)明顯改變；⑵流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL法結(jié)果均顯示：高糖刺激組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于對(duì)照組；⑶高糖刺激組較正常對(duì)照組足細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrialtranmembrane pitentials，△ψm)明顯下降；⑷免疫組化結(jié)果

6、：對(duì)照組足細(xì)胞Caspase-3有少量陽(yáng)性表達(dá)，高糖刺激后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)；⑸Western blot結(jié)果：高糖刺激組Cytochrome C、Caspase-3表達(dá)較正常對(duì)照組增高。
　　結(jié)論：高糖刺激的足細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降，釋放到胞質(zhì)中的Cyt-c增高，Caspase-3表達(dá)上調(diào)，提示高糖刺激引起了足細(xì)胞中線粒體功能障礙，其相關(guān)凋亡途徑可能參與了足細(xì)胞的凋亡過(guò)程，并在DN的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作