主要蟲媒病毒基因芯片檢測方法的建立.pdf

1、蟲媒病毒(Arbovirus)是指一類通過吸血昆蟲叮咬敏感的脊椎動(dòng)物而在人、畜間傳播的病毒。其特點(diǎn)是病毒可在昆蟲體內(nèi)繁殖，但昆蟲本身不發(fā)病，通過叮咬將病毒傳播給人、畜，引起人畜患病。蟲媒病毒分布在黃病毒科、披膜病毒科、布尼亞病毒科等14個(gè)科，全世界目前已發(fā)現(xiàn)530余種，其中在我國已分離到的有9種，實(shí)際我國存在的蟲媒病毒可能遠(yuǎn)不止以上這些。另外，隨著國際交往的日益頻繁，境外蟲媒病毒病傳入我國的可能性也顯著增加，因此，快速準(zhǔn)確地檢測蟲媒病毒

2、的感染在傳染病防控上具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種快速高通量的新技術(shù)，具有高通量、高度平行性及高度自動(dòng)化等特點(diǎn)。本研究以甲病毒屬的東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis virus，EEEV)、西方馬腦炎病毒(Western equineencephalitis virus，WEEV)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalit

3、isvirus，VEEV)、辛德畢斯病毒(sindbis virus)和馬雅羅病毒(Mayaro virus)，黃病毒屬的登革熱病毒(Dengue fever virus)、西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)、日本乙型腦炎病毒(Japanese B encephalitis virus，JBEV)和森林腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)，漢坦病毒屬的漢坦病毒(Hantaan

4、 virus)及布尼亞病毒屬的布尼安亞病毒(Bunyamwera virus)等13種主要蟲媒病毒為研究對象，利用基因芯片技術(shù)，設(shè)計(jì)針對以上病毒的種及屬水平的寡核苷酸探針，建立能對這些病毒進(jìn)行屬水平篩查及種水平鑒定的基因芯片技術(shù)，通過屬和種水平的檢測結(jié)果相互驗(yàn)證，為蟲媒病毒的檢測與鑒定提供一種高通量的新方法。 首先，從Genebank獲得以上蟲媒病毒的全部基因組序列，利用ClustalX和BLAST等比對軟件，設(shè)計(jì)針對13種蟲媒

5、病毒所在的3個(gè)屬的通用寡核苷酸探針，用于病毒的屬水平篩查。然后設(shè)計(jì)針對每種病毒的特異性寡核苷酸探針，用于每種病毒的檢測鑒定。寡核苷酸探針長度均為70-mer，Tm值為80±5℃。將設(shè)計(jì)好的探針與Genebank上所有病毒基因組序列進(jìn)行比對，驗(yàn)證其種屬特異性，然后進(jìn)行探針合成和基因芯片制備。所有病毒在BSL-3和BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)，待檢病毒核酸通過錨定隨機(jī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)熒光染料標(biāo)記后與基因芯片雜交，利用激光共聚焦掃描儀掃描后進(jìn)行

6、結(jié)果分析。在對基因芯片雜交條件、洗滌條件等進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對以上13種病毒分別進(jìn)行單個(gè)病毒標(biāo)本及兩種以上病毒的模擬混合感染標(biāo)本進(jìn)行檢測，同時(shí)對該檢測方法的特異性、敏感性及可重復(fù)性等進(jìn)行驗(yàn)證。 針對甲病毒屬、黃病毒屬和布尼亞病毒屬各設(shè)計(jì)了3～10條屬水平探針。在此基礎(chǔ)上，針對每種病毒各設(shè)計(jì)5條寡核苷酸檢測探針以及相同數(shù)量的互補(bǔ)序列探針，以覆蓋該病毒所有的分離株。探針長度均為70mer，Tm值介于75～85℃，探針總數(shù)為153條。

7、利用優(yōu)化后的雜交條件，對13種蟲媒病毒的分別檢測均獲得了種及屬特異性雜交信號(hào)，非特異雜交不明顯。將乙型腦炎病毒和馬雅羅病毒混合后，模擬混合病毒感染，也得到了乙型腦炎病毒和馬雅羅病毒種和屬的特異雜交信號(hào)。以丙型肝炎病毒、狂犬病毒和風(fēng)疹病毒作為對照以同樣方法與芯片進(jìn)行雜交，均未得到陽性檢測結(jié)果，表明該芯片具有良好的特異性。以馬雅羅病毒核酸為待檢標(biāo)本，進(jìn)行基因芯片敏感度的測定，結(jié)果顯示，病毒核酸量≥0.003pmol時(shí)，可得到良好的雜交信號(hào)(

8、1g信號(hào)強(qiáng)度≥2.5)。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片檢測方法的特異性，對所檢測的每一種病毒同時(shí)進(jìn)行了PCR檢測。兩種檢測所采用的核酸為同一批次提取的病毒RNA，以確保驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。結(jié)果顯示，兩種檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步表明我們所建立的基因芯片檢測方法具有較好的特異性。 聯(lián)合應(yīng)用本研究芯片和本室以前建立的人類致病病毒屬水平篩查基因芯片對一株新分離病毒進(jìn)行了篩查和檢測，檢測結(jié)果顯示該病毒為乙型腦炎病毒，與PCR及測序結(jié)果一致。