四種蟲媒病毒多重RT-PCR方法的初步建立.pdf

1、蟲媒病毒(Arboviruses)是指通過吸血節(jié)肢動(dòng)物叮咬敏感脊椎動(dòng)物宿主而在人畜間進(jìn)行傳播的一類病毒，故可導(dǎo)致人畜共患病。國(guó)際上已發(fā)現(xiàn)537種，其中130余種與人類傳染性疾病有關(guān)。目前，蟲媒病毒已成為世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。隨著國(guó)際交往的日益頻繁，境外蟲媒病毒病傳入我國(guó)的可能性也顯著增加，因此，同時(shí)、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)蟲媒病毒的感染具有重要的意義。 多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR，M-RT-PCR)是在

2、普通RT-PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)或兩對(duì)以上的引物，用于同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或兩個(gè)以上的目的基因。不僅能同時(shí)檢測(cè)多種病原，保持普通RT-PCR敏感性高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，而且具有節(jié)約模板和時(shí)間等一系列優(yōu)點(diǎn)。 本研究以日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)、黃熱病毒(YellowFever Virus，YFV)、西尼羅病毒(West Nile Virus

3、，WNV)和圣路易斯腦炎病毒(St.Louis encephalitis virus，SLEV)四種蟲媒病毒為研究對(duì)象，利用M-RT-PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)以上病毒的特異性引物進(jìn)行同步多重檢測(cè)。目的在于初步建立檢測(cè)四種蟲媒病毒的M-RT-PCR方法，為檢測(cè)蚊子攜帶一種或多種病毒提供了一種快速、準(zhǔn)確、可靠的診斷技術(shù)，也使得國(guó)境口岸大規(guī)模篩查和日常蚊蟲的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)更加高效、快捷。 材料與方法： 1、引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Ge

4、nBank中已經(jīng)發(fā)表的JEV、YFV、WNV和SLEV的全基因序列，利用DNAStar軟件找到四種病毒的保守序列，再利用Primer Premier5軟件針對(duì)四種病毒的保守序列設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物。 2、JEV和YFV病毒滴度測(cè)定 實(shí)驗(yàn)中的JEV和YFV分別為SA-14-14-2和17D減毒活疫苗株，經(jīng)BHK21細(xì)胞培養(yǎng)，80％病變時(shí)收獲。將病毒液倍比稀釋后96孔板培養(yǎng)，然后采用Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

5、 3、pWNV-prM、pSLEV-CprM體外轉(zhuǎn)錄及RNA拷貝數(shù)的計(jì)算 先將質(zhì)粒單酶切使DNA線性后，按試劑盒說明操作進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，然后檢測(cè)RNA質(zhì)量及測(cè)定濃度，最后計(jì)算拷貝數(shù)。 4、四種病毒單重RT-PCR方法的建立 將四種蟲媒病毒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR特異性檢測(cè)：?jiǎn)我灰餀z測(cè)混合模板和混合引物檢測(cè)單一模板；PCR的靈敏度的檢測(cè)：JEV、YFV的病毒液倍比稀釋后每個(gè)稀

6、釋度分別提取RNA后RT-PCR檢測(cè)和WNV、SLEV的重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄后的RNA加入正常細(xì)胞液中提取RNA后RT-PCR檢測(cè)。 5、M-RT-PCR方法的初步建立和條件優(yōu)化 分別選擇四種病毒的一個(gè)適當(dāng)稀釋度作為模板，等量混合，四種引物等量混合，RT-PCR反應(yīng)條件和體系與單重RT-PCR反應(yīng)相同。根據(jù)電泳結(jié)果，主要對(duì)引物濃度、Mg2+濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、設(shè)計(jì)引物 經(jīng)過序列比對(duì)

7、驗(yàn)證了引物具有良好的代表性，引物擴(kuò)增的序列與其它毒株的同源性都很高，基本保證了引物設(shè)計(jì)的可行性。JEV、YFV、WNV和SLEV的引物分別為JS3-1F:AGAGCGGGGAAAAAGGTCAT，JS3-1R:TTTCACGCTCTTTCTACAGT，YFE-4F: CTTACAGCGGCAATCAA，YFE-4R: AGGCAGAGCCAAACACC，WNM-1F: AGGTGATGATGACGGTAAAT，WNM-1R: AAGCA

8、ATAGCACGACAAACA，SLCM-1F: TAGCCATCCTGACATTCTTC，SLCM-1R: CTGTGTGTTGTTGCTGCCTA。擴(kuò)增的片段大小分別為162bp、307bp、455bp和674bp。 2、病毒滴度測(cè)定及RNA拷貝數(shù)計(jì)算結(jié)果 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析和公式計(jì)算，JEV和YFV的病毒滴度分別為1.6×106PFU/ml和4.4×105PFU/ml；經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)量體外轉(zhuǎn)錄后RNA的濃度和計(jì)算RNA

9、分子量后得出pWNV-prM-RNA的拷貝數(shù)為2.10×1015/ml，pSLEV-CprM-RNA的拷貝數(shù)為6.22×1015/ml。 3、四種病毒單重RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng) 經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證引物具有良好的特異性，JEV和YFV的RT-PCR最低檢測(cè)病毒滴度分別為128PFU/ml和35PFU/ml，pWNV-prM-RNA和pSLEV-CprM-RNA的RT-PCR最低檢測(cè)拷貝數(shù)分別為2.10×103/ml和3.11×104

10、/ml。 4、M-RT-PCR的初步建立及條件優(yōu)化 經(jīng)條件的優(yōu)化，M-RT-PCR最佳條件如下： 引物濃度：JEV和SLEV的引物濃度0.5μM，YFV和WNV的引物濃度在1μM；退火溫度：49.4℃；Mg2+濃度：3mM；dNTP濃度為：250μM。 結(jié)論： 1、設(shè)計(jì)了可以用于多重檢測(cè)JEV、YFV、WNV和SLEV的4對(duì)特異性引物； 2、建立了JEV、YFV、WNV和SLEV的單重RT