食源性致病菌多重PCR和基因芯片檢測(cè)方法的建立.pdf

1、食源性致病菌是危害食品安全和人類(lèi)健康的主要因素。常見(jiàn)的食源性致病菌主要包括金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門(mén)氏菌、阪崎腸桿菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7和空腸彎曲桿菌。本研究利用基因組比對(duì)方法挖掘單核細(xì)胞增生李斯特菌、阪崎腸桿菌和腸出血性大腸桿菌O157:H7基因組中的特異性序列，建立了相關(guān)檢測(cè)靶點(diǎn)庫(kù)，設(shè)計(jì)和篩選特異性引物。同時(shí)整合其它已挖掘和報(bào)道的檢測(cè)靶點(diǎn)和引物，利用篩選和整合的引物建立多重PCR體系

2、和基因芯片方法，檢測(cè)上述八種食源性致病菌。主要研究?jī)?nèi)容如下： ⑴多重PCR檢測(cè)體系。利用引物nuc-j，Vp2，prs，C20，SG，ial，hly-A和hipO1，建立了八種食源性致病菌多重PCR檢測(cè)體系，經(jīng)優(yōu)化后確定退火溫度Tm值和Mg2+濃度分別為56oC和1.5 mmol/l，多重基因組DNA檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10 pg。 ⑵基于單堿基延伸標(biāo)簽反應(yīng)的玻片芯片方法。通過(guò)多重PCR和玻片芯片技術(shù)聯(lián)用，設(shè)計(jì)SBE-tag

3、s引物進(jìn)行熒光標(biāo)記反應(yīng)，建立八種食源性致病菌的玻片芯片檢測(cè)方法。該芯片方法的多重基因組DNA檢測(cè)靈敏度和細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度分別為0.1 pg和5.0×102 cfu/ml，分離菌株檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法的符合率達(dá)到100％。 ⑶管式流動(dòng)芯片檢測(cè)方法。應(yīng)用管式流動(dòng)芯片系統(tǒng)檢測(cè)八種食源性致病菌，檢測(cè)高效特異，細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度可達(dá)到6.2×102 cfu/ml。相比較基于單堿基延伸標(biāo)簽反應(yīng)的玻片芯片方法，管式流動(dòng)芯片檢測(cè)時(shí)間短1