檢測口蹄疫病毒基因芯片技術與3B-ELISA鑒別診斷方法研究.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouthdisease)是人畜共患的烈性傳染病，病原為口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV)，該病被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)確定為對動物和動物產(chǎn)品國際貿(mào)易有重大影響的A類疾病。預防和控制口蹄疫的關鍵是使用免疫效果好的疫苗和快速準確的診斷方法。傳統(tǒng)的方法有病毒分離、乳鼠接種試驗等。基因芯片是近幾年出現(xiàn)的新技術，具有快速和靈敏度高的特點，可以應用于微生物的檢測，該特點符合口

2、蹄疫診斷的需要；另外，在臨床實際中，區(qū)分口蹄疫病毒自然感染和疫苗免疫動物的快速鑒別診斷方法對于該病的控制具有重要的現(xiàn)實意義。為此，本研究開展了以下兩個方面的工作。 1.檢測口蹄疫病毒基因芯片技術的研究 本研究根據(jù)O型口蹄疫病毒拓撲型理論和Genbank上公布的口蹄疫病毒的核酸序列，借助DNAman5.2.2和PrimerPremier5.0生物學軟件設計了檢測口蹄疫病毒的6條種屬探針和12條拓撲型探針，每個探針5’端連接

3、12T后氨基修飾，然后通過點樣、固定、封閉等步驟將探針固定在醛基化玻璃片上制備成檢測芯片。分別提取5株口蹄疫病毒的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR摻入Cy3-dCTP熒光標記后，與芯片上的探針特異性雜交，然后對芯片進行掃描，根據(jù)熒光強度判斷檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，5株口蹄疫病毒均能被檢出，與基因測序結(jié)果基本一致，表明本法可以用于口蹄疫病毒的檢測。 2.口蹄疫3B-ELISA鑒別診斷方法的初步建立 從口蹄疫病毒細胞培養(yǎng)物中提取總RNA

4、，經(jīng)一步法RT-PCR獲得了長度約230bp的3B基因片段，將PCR產(chǎn)物連接到pMD-18-T載體，獲得重組質(zhì)粒并測序，用BamHⅠ與HindⅢ雙酶切此重組質(zhì)粒后，回收3B基因并連接到pGEX-KG載體上形成表達質(zhì)粒pGEX-KG-3B，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，篩選陽性重組工程菌；重組蛋白在27℃下，用IPTG誘導表達，將表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)斑點雜交，結(jié)果表明3B基因主要以可溶形式高效表達，表達產(chǎn)物具有免疫原性。以純化的

5、表達產(chǎn)物為抗原建立了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(I-ELISA)方法。方陣滴定確定最佳包被濃度是6.1μg/孔，最佳血清稀釋倍數(shù)為1：80；通過測定36份FMDV陰性血清，確定了該方法的陽性判定標準。特異性、重復性試驗結(jié)果表明，該方法特異性強、重復性好；用3B-ELISA方法與美國聯(lián)合生物醫(yī)學公司(UBI)生產(chǎn)的合成肽檢測試劑盒UBI(R)FMDVNS-ELISA對比檢測44份血清，符合率為87.1％。證明3B-ELISA方法可用于口蹄疫的鑒