嗜酸氧化亞鐵硫桿菌中金屬抗性相關(guān)基因的克隆及轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異性研究.pdf

1、在Acidithiobacillus ferrooxidans(A.ferrooxidans) ATCC23270的全基因組中許多基因被注釋為金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體或結(jié)合蛋白，本文選取六個與金屬轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)合相關(guān)的基因(afe_0654，afe_0671，afe_0674，afe_1143，afe_1144和afe_2126)，研究它們在Mn2+，Zn2+和Cd2+刺激下mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，為研究A.ferrooxidans耐受高濃度金屬離子的分子機(jī)制

2、奠定基礎(chǔ)。
　　 克隆實(shí)驗表明目標(biāo)基因存在于A.ferrooxidans DC中，測序及比對結(jié)果表明A.ferrooxidans DC中六個基因的序列與A.ferrooxidansATCC23270對應(yīng)的基因的序列一致。生物信息學(xué)分析表明afe_0654編碼重金屬結(jié)合蛋白;afe_0671和afe_1144編碼屬于CzcA家族的十二次跨膜的重金屬外排泵蛋白;afe_0674編碼重金屬外排系統(tǒng)蛋白;afe_1143編碼位于細(xì)胞質(zhì)膜

3、外側(cè)的重金屬外排轉(zhuǎn)運(yùn)體;afe_2126編碼位于細(xì)胞膜上的跨膜十一次的屬于金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，屬于二價陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白NRAMP（natural resistance-associated macrophage protein）家族。細(xì)菌中CzcA是復(fù)合物CzcCBA的組分，化學(xué)滲透復(fù)合物CzcCBA是由CzcC（小的外膜蛋白），CzcB（連接CzcA與CzcC形成一個連續(xù)的從細(xì)胞質(zhì)到胞外的通道的周質(zhì)耦合蛋白）和CzcA（一個大的內(nèi)膜蛋白）

4、組成一個內(nèi)外膜通道。另外，作為離子/質(zhì)子交換載體外排Cd2+，Zn2+和Co2+的CzcCBA復(fù)合物是金屬抗性家族RND(for Resistance, Nodulation and Division)的成員。
　　 A.ferrooxidans DC對Mn2+，Zn2+和Cd2+的最大耐受濃度的測定。耐受實(shí)驗表明在亞鐵作為能源物質(zhì)時A.ferrooxidans DC對Mn2+，Zn2+和Cd2+的最大耐受濃度分別是0.52，0

5、.42和0.16 mol/L。硫粉作為能源物質(zhì)時A.ferrooxidans DC對Mn2+，Zn2+和Cd2+的最大耐受濃度分別0.38，0.14和0.08mol/L。耐受實(shí)驗表明亞鐵作為能源物質(zhì)時A.ferrooxidans DC耐受更高濃度的金屬離子。三種金屬離子對A.ferrooxidans DC的毒性依次是Cd2+＞Zn2+＞Mn2+。
　　 實(shí)驗中采用real-time quantitative PCR(RT-qPC

6、R)來研究A.ferrooxidans DC在Mn2+，Zn2+和Cd2+刺激下目標(biāo)基因的差異性表達(dá)。結(jié)果顯示在Mn2+刺激下亞鐵作為能源物質(zhì)時目標(biāo)基因均上調(diào)。在Zn2+刺激下亞鐵作為能源物質(zhì)時afe_0654和afe_0674下調(diào)，其余基因上調(diào);以硫粉作為能源物質(zhì)時目標(biāo)基因均上調(diào)。在Cd2+刺激下afe_2126下調(diào)，其余基因上調(diào)。根據(jù)RT-qPCR的結(jié)果我們推測afe_0671，afe_1143，afe_1144和afe_2126編