雙光子細胞膜和核糖核酸探針的合成及其在活細胞熒光成像中的應(yīng)用.pdf

1、最近研究表明，在活體成像中，雙光子熒光顯微成像技術(shù)比共聚焦成像具有更多的優(yōu)點。該技術(shù)具有低的光毒性和光漂白性、高的檢測靈敏度和無成像扭曲等優(yōu)勢。另外，由于雙光子顯微鏡其本身就有高的軸向分辨率，它不需要像共聚焦顯微鏡那樣通過針孔來提高成像效果。更重要的是，由于它的長波段激發(fā)有效避免了細胞的光損傷，避開了紫外和藍光的照射并且使散焦照射減少。從而使得雙光子顯微鏡可以在不損害細胞活性的條件下對細胞進行長時間連續(xù)成像。為了適應(yīng)當(dāng)前形勢，各種能夠成

2、像活細胞內(nèi)不同靶標的熒光探針已經(jīng)被廣泛的運用到雙光子熒光顯微成像研究中。但是，目前在細胞和組織的三維成像檢測中，依然缺乏優(yōu)良的雙光子熒光探針，這一現(xiàn)狀亟待解決。本論文主要對不同雙光子熒光探針的成像特點進行了研究。
　　首先，本論文介紹了細胞膜探針。生物膜是通過脂質(zhì)、蛋白和糖類等自組裝而成的雙層膜結(jié)構(gòu)。在這個復(fù)雜的結(jié)構(gòu)中，脂質(zhì)是膜骨架中的主要組成成分，對膜的功能和性質(zhì)產(chǎn)生巨大影響。通過最近生物膜理論分析，生物膜的構(gòu)成中由富含膽固醇和

3、鞘磷脂的膜有序相和含非飽和鏈脂質(zhì)體和膽固醇的膜無序相組成。在細胞膜的相態(tài)研究中，有序相的假設(shè)主要是來自富含膽固醇和鞘磷脂的不溶性細胞膜碎片的發(fā)現(xiàn)，這種假設(shè)一直激發(fā)著相關(guān)學(xué)者深入的研究和討論，這是由于它們的證據(jù)主要通過間接的技術(shù)來提供，所以一直未能實現(xiàn)有序相的可視性。一些研究者認為，有序相參與了相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞粘附、信號傳遞和脂質(zhì)體或蛋白的轉(zhuǎn)運。一直以來，研究者是通過人工膜模仿有序相來代替對細胞膜相關(guān)區(qū)域進行研究。近年來，生物膜有序相

4、是當(dāng)前的研究熱點，但是在細胞膜相關(guān)區(qū)域的研究仍然具有挑戰(zhàn)。綜上所述，為了更好的理解有序相在生物膜內(nèi)的作用，必須實現(xiàn)生物膜該區(qū)域的可視性。但是，由于生物膜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，對細胞及組織意義上的有序相研究一直存在困難，為了成像活細胞膜的有序相，在第二章中，本論文設(shè)計合成了一種新型的熒光探針HVC-12，該探針基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光的機理選擇性成像了細胞膜和組織中的有序相。由于探針HVC-12聚集誘導(dǎo)發(fā)光的特性，它的納米聚集顆粒點亮了細胞膜的剛性區(qū)域。

5、本論文首次發(fā)現(xiàn)，在活細胞膜上有序相呈現(xiàn)的是非連續(xù)的分布（1-1.5μm的間隔）。更重要的是，這種探針與商業(yè)化的膜探針（如DiD）相比，探針HVC-12對細胞膜表現(xiàn)出了高的靈敏性;大的斯托克斯位移和雙光子活性吸收截面;好的光穩(wěn)定性;并能成像和追蹤細胞膜的動態(tài)變化。這些優(yōu)異的光物理性質(zhì)，使這種新型的探針HVC-12成為研究生物膜強有力的工具。
　　其次，核酸是細胞中重要的生物大分子，其定量分析、特異性識別、對基因組學(xué)、病毒學(xué)、分子生物

6、學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展具有十分重要的意義。本論文針對核酸開展包括DNA及RNA在內(nèi)的雙光子核酸探針的制備及細胞成像方面的研究工作?；谇捌诠ぷ鳎菊撐耐ㄟ^雙光子核酸探針的設(shè)計、合成及表征，探索陽離子有機小分子專一性識別內(nèi)源性RNA的內(nèi)在規(guī)律、分子構(gòu)型對專一性識別能力的影響，掌握核酸探針的調(diào)控機制，最終達到了制備核酸探針的目的。我們知道，多種多樣的分子探針一直為檢測活細胞內(nèi)的RNA而研發(fā)，包括寡核苷酸探針、非線性熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針、雙標記的

7、寡核苷酸發(fā)夾探針（分子信標）、雙熒光共振能量轉(zhuǎn)移分子信標、自動結(jié)扎探針和利用蛋白作報道基團的探針。但是，這些RNA探針不具有好的膜通透性，它常常通過微注射技術(shù)進入活細胞進行標記。但是這種技術(shù)往往造成細胞損傷從而造成細胞的生物功能的紊亂，因此，開發(fā)一種低分子量的膜通透性雙光子RNA熒光探針是非常重要的。
　　在本論文的第三章中，基于吲哚的單離子鹽（INR1/INR2）被成功合成和表征，通過體外的波譜分析和在不同細胞系內(nèi)的單雙光子成像

8、研究發(fā)現(xiàn)，INR1和INR2作為兩種選擇性熒光開關(guān)探針，與RNA綁定后，探針都具有大的雙光子活性吸收截面。在活細胞染色實驗中，兩種探針具有好的膜通透性，并能用雙光子和共聚焦顯微鏡能在活細胞的細胞質(zhì)和核仁中成像RNA。此外，它們在與一種重要的DNA-RNA共區(qū)域化的DNA染料Hoechst33342復(fù)染活細胞時，表現(xiàn)出好的復(fù)染兼容性。
　　在本論文的第四章中，一種新的咔唑雙離子鹽HVC-6被設(shè)計和合成。更重要的是，在活細胞和固定細胞

9、中，它能夠雙光子成像細胞內(nèi)分布在細胞質(zhì)和核仁區(qū)域的RNA.。而且，它們在與另一種重要的DNA-RNA共區(qū)域化的DNA染料DAPI復(fù)染活細胞時，表現(xiàn)出好的復(fù)染兼容性。
　　在本論文的第五章中還是集中于能夠成像細胞內(nèi)的靶標的小分子量探針的研究。在本章中，基于吲哚單離子鹽，本章設(shè)計了低分子量的線粒體探針I(yè)NSC12。由于這種鹽的熒光團具有長的烷基鏈，分子與脂質(zhì)膜可以產(chǎn)生強的相互作用，探針I(yè)NSC12表現(xiàn)出好的膜通透性，并在短時間內(nèi)能夠點

10、亮細胞膜并進一步點亮細胞內(nèi)的線粒體。更重要的是，這種探針擁有快速檢測線粒體的能力，并能在長時間內(nèi)觀測到線粒體的動態(tài)變化，一定程度上承受了微環(huán)境變化的耐性。
　　綜上所述，本論文中一些高靈敏性的細胞膜、RNA和線粒體探針(HVC-12/HVC-18，INR1/INR2/HVC-6和INSC12)被成功設(shè)計和合成。尤其是本章基于全新的AIE機理在活細胞和深層組織中首次實現(xiàn)了對細胞膜有序相的檢測。另外，利用共聚焦和雙光熒光顯微鏡，探針I(yè)