雙光子熒光粘度探針及其活細(xì)胞成像研究.pdf

1、自從Denk等人發(fā)展雙光子熒光三維成像技術(shù)以來,人們相繼開展了大量活細(xì)胞和組織的雙光子生物熒光顯微成像研究工作。與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡以及激光掃描共焦顯微鏡相比,雙光子生物熒光顯微鏡具有三維空間分辨率高、穿透深度大、自發(fā)熒光弱、光損傷小等特點(diǎn)。與普適性熒光顯微鏡、及激光掃描共焦顯微鏡的一個重要的不同之處在于:雙光子熒光顯微鏡要求熒光探針具有較高的雙光子熒光活性吸收截面。但雙光子熒光探針的研究工作的相對滯后卻限制了它在活性生物組織

2、與細(xì)胞內(nèi)縱深方向的大深度、高精度的斷層熒光探測和成像方面的應(yīng)用研究。因此,發(fā)展具有大的雙光子熒光活性吸收截面的雙光子熒光探針具有非常重要的科學(xué)價值和研究意義。目前關(guān)于雙光子生物熒光探針的開發(fā)已成為一個國際研究熱點(diǎn)。
　　細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)室的流體的粘度有很大差異,例如,細(xì)胞中胞質(zhì)液的粘度值和水的粘度值很接近,約為1-2cp;而細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)附近的粘度值可高達(dá)140cp。細(xì)胞內(nèi)的流體粘度與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物大分子之間的作用以及

3、代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散等密切相關(guān)。比如,細(xì)胞質(zhì)粘度的改變會影響到心肌細(xì)胞和肺巨噬細(xì)胞的生物活性,而白細(xì)胞膜粘度的增加會加速衰老,等等。因此,在細(xì)胞水平上檢測微環(huán)境的粘度是一個重要的科學(xué)命題。目前雖然有許多熒光粘度探針被報道,但能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞特別是活細(xì)胞成像的粘度探針還比較少,而能夠?qū)崿F(xiàn)活細(xì)胞成像的雙光子熒光粘度探針尚未見報道。
　　因?yàn)闊晒馓结樤诩?xì)胞內(nèi)的分布是未知的,同時探針的熒光強(qiáng)度受到探針濃度的影響,所以單純地通過熒光強(qiáng)度的改變來檢測細(xì)

4、胞內(nèi)的微粘度的熒光探針只能給出細(xì)胞內(nèi)高粘度區(qū)域的熒光圖像,但不能給出細(xì)胞內(nèi)熒光成像區(qū)域的粘度值相對大小的梯度分布圖像。然而采用比率熒光粘度探針可以消除探針濃度以及儀器設(shè)備等因素引起的干擾等,從而給出細(xì)胞內(nèi)熒光成像區(qū)域的微粘度梯度分布圖像。
　　在實(shí)驗(yàn)工作中,首先發(fā)現(xiàn)探針A1是具有紅光發(fā)射特性的雙光子熒光粘度探針;而且根據(jù)實(shí)驗(yàn)和理論分析,認(rèn)為探針A1也是一個單光子比率熒光粘度探針;進(jìn)而經(jīng)過對探針A1雙光子吸收和熒光性能的分析,提出將