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文檔簡介
1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
第一部分TET酶及5-mC,5-hmC在人類早孕期絨毛組織中的表達趨勢
目的:
多項研究已闡明TET蛋白及催化生成的5-hmC參與了胚胎干細胞的維持和分化過程,去甲基化可能存在于原生殖細胞和胚胎早期發(fā)育的各個階段。最近的一篇報道,在豬的早孕胚胎中,TET3在2細胞期高表達,而TET1,TET2則富集在囊泡階段。TET1,TET2,TET3三種蛋白都有不同組織及細胞內(nèi)將5-m
2、C轉(zhuǎn)變成5-hmC的功能。TET蛋白和5-hmC的研究為DNA甲基化/去甲基化及其生物學(xué)功能提供了新的視點,關(guān)于它們的表達及功能在人類絨毛組織中的研究有限?;钴S的DNA甲基化及去甲基化在即將發(fā)育成胚胎與即將發(fā)育成胚外譜系的細胞間發(fā)揮著重要的作用,無論是胚胎種植前還是種植后。絨毛組織的生物學(xué)功能類似于胚胎干細胞,那么TET酶及5-mC,5-hmC在人類早孕期絨毛組織中的表達量及表達趨勢是怎樣的呢?我們對此做一研究。
方法:
3、> 1.本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,標本收集經(jīng)患者知情同意。2012年9月至2013年5月于廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收集:自愿選擇終止妊娠婦女的正常絨毛31例。絨毛樣本均為孕6-8+6周,母齡18-42歲。根據(jù)絨毛組織的不同發(fā)育時期分為3個研究組:①6周(n=10),②7周(n=10),③8周(n=11)。
2.人流手術(shù)后,即用生理鹽水漂洗2-3次以去除絨毛組織上帶有的血跡,采用50ml無菌離心管收集絨毛組織,內(nèi)置
4、1×PBS溶液,顯微鏡下挑選、剪取絨毛組織,分裝入1.5ml EP管內(nèi),凍存-80°。首先進行TET mRNA的檢測:應(yīng)用BiooPure RNA Isolation Reagent(Bioo,USA)提取絨毛組織RNA,RNA的純度和濃度鑒定后行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Fermentas K1622嚴格按照試劑操作說明)。RNA水平實驗得出初步結(jié)論后,Western-bloting方法用于TET蛋白表達的驗證:絨毛組織組織總蛋白的提取,蛋白質(zhì)變性
5、、轉(zhuǎn)膜、封閉及抗體孵育、顯影及圖像分析,完成實驗。最后一步,全基因組5-hmC及5-mC的定量檢測。采用Wizard(R)Genomic DNA Purification Kit(Promega)試劑盒提取DNA,DNA的純度和濃度鑒定后,嚴格按照(Epigentek公司) MethylFlashHydroxymethylated DNA Quantification Kit及MethylFlash Methylated DNAQuan
6、tification Kit操作說明書操作,檢測樣品的上樣檢測量是200ng。
3.采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件(Statistical Package for the Social Sciences),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(x±E)表示。組間數(shù)量資料比較采用t-test或One-way ANOVA,方差不齊時采用Welch近似方差檢驗,雙變量相關(guān)分析。設(shè)雙側(cè)檢驗,P<0.05為差異顯著水平,P<0.01為差異極顯著水平。
7、> 結(jié)果:
1.采用熒光定量PCR技術(shù)檢測TET1,TET2,TET3 mRNA在人類早孕絨毛組織中的表達情況,TET1,TET2,TET3的表達均會隨著孕周的增加而下降,尤以TET3下降明顯(6周vs.7周,P<0.05;6周vs.8周,P<0.05)。三種TET mRNA均在孕6周的絨毛組織中表達是最高的,與孕8周組相比有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。
2.我們應(yīng)用Western-bloting的方法驗證了TET1,TET
8、2,TET3蛋白在人類早孕絨毛組織中的表達,進一步證實了TET mRNA水平上的實驗結(jié)果。實驗過程中所應(yīng)用標本與RT-PCR中一致,TET1,TET2,TET3蛋白的表達同樣會隨著孕周的增加而下降,而且在各組之間的表達存在著明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。在孕6周組,TET1,TET2,TET3蛋白的表達明顯高于孕7周組和孕8周組。在7周和8周的組間比較上未得到統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果。
3. 5-hmC在早孕絨毛組織中的表達與TET酶的表達趨勢比
9、較一致,隨著孕周數(shù)的增加,表達量下降。以孕6周的絨毛組織中表達最高(6周vs7周,P<0.01;6周vs8周,P<0.01)。同時,5-mC在早孕絨毛組織中的表達也會隨著TET酶的表達量的減少而呈下降趨勢(6周vs8周,P<0.01;7周vs8周,P<0.01),在孕6周時表達量顯著高于其它孕周數(shù)(P<0.05)。
結(jié)論:
1.本研究發(fā)現(xiàn)TET1,TET2,和TET3 mRNA在人類早孕期絨毛組織中的表達是隨著孕周的
10、增加而逐步下降的(6周,7周,8周)。顯而易見,在這三個實驗組的比較中,TET1,TET2,和TET3 mRNA在孕6周時表達最旺盛。同樣的標本,TET蛋白的半定量檢測同時證明了這一下降趨勢的存在。
2.TET1、TET2、TET3在早期妊娠發(fā)育過程中確有在母胎界面的絨毛組織中表達,并且在孕6-8周的階段,有逐漸減弱的趨勢。3個TET蛋白在早孕絨毛組織內(nèi)可能發(fā)揮著將5-mC轉(zhuǎn)變成5-hmC的作用。
3. 5-hmC及
11、5-mC在早孕絨毛組織中的表達與TET酶的表達趨勢比較一致,隨著孕周數(shù)的增加,表達量下降,并以孕6周的絨毛組織中表達最高,孕8周時表達最低。由此猜測,在早期妊娠自孕6周進展到孕8周的階段的絨毛組織中,無論是甲基化的過程,亦或是去甲基化的過程都在減弱。
第二部分TET酶的缺乏及相關(guān)的去甲基化異常與人類早期自然流產(chǎn)的相關(guān)性研究
目的:
本部分擬從不同時期、不同類型停止發(fā)育的早孕絨毛組織的甲基化/去甲基化動態(tài)變化
12、的角度,研究TET蛋白,5-mC,5-hmC在人類早孕絨毛組織中全基因組的變化模式,分析去甲基化與自然流產(chǎn)的病因和發(fā)病機制之間的關(guān)系。
方法:
(1)本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,標本收集經(jīng)患者知情同意。2012年9月至2013年5月于廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收集:自愿選擇終止妊娠婦女的正常絨毛31例。2012年5月至2013年5月于廣州市婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收集:早期胚胎停止發(fā)育的絨毛30例。絨毛樣本均為
13、孕6-8+6周,母齡18-42歲。收集人早孕期絨毛組織分為兩組:一組為胚胎停育,作為研究組(EPL組);二組為正常妊娠,作為對照組。
(2)獲取絨毛組織后,即用生理鹽水漂洗2-3次以去除絨毛組織上帶有的血跡,采用50ml無菌離心管收集絨毛組織,內(nèi)置1×PBS溶液,顯微鏡下挑選、剪取絨毛組織,分裝入1.5ml EP管內(nèi),凍存-80。
(3)采用t-test或One-way ANOVA進行組間數(shù)量資料比較,方差不齊時采用
14、Welch近似方差檢驗。設(shè)雙側(cè)檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01為差異極顯著水平。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤((x)±E)表示。
結(jié)果:
1.正常妊娠組的TET1,TET2,TET3 mRNA水平均高于EPL組(TET1 P<0.01,TET2 P<0.01,TET3 P<0.05)。也就是說,在孕6-8周的早期妊娠中,與正常妊娠相比,流產(chǎn)的絨毛組織中三種TET mRNA的含量有
15、所下降。在EPL組中,以孕周數(shù)作為分組依據(jù)的三個亞組中,三種TET mRNA的表達在孕6周,7周,8周組之間比較無顯著差別(P>0.05)。另外根據(jù)臨床類型分組中,無論是在空囊型的早孕絨毛,有胚芽無胎心型流產(chǎn)的早孕絨毛,還是已有胎心后停育型的流產(chǎn)絨毛組織中,TET1,TET2,TET3 mRNA表達均未見差別。
2.TET1,TET2和TET3蛋白的表達隨著孕周的增加而下降,以EPL組的明顯減弱。在孕6周組中,TET1,TET
16、2,TET3蛋白的表達明顯高于孕7周組和孕8周組以及EPL組。免疫組化圖片顯示:TET1,TET2和TET3主要表達于絨毛滋養(yǎng)細胞,呈以細胞漿為主的表達,細胞核為陰性反應(yīng)。仍然是表達在孕6周時最為明顯。
3. 5-mC在正常妊娠的絨毛組織中表達低于在流產(chǎn)的絨毛組織中的表達,差異達到顯著水平。但是,5-hmC在絨毛組織中的表達量整體偏低,流產(chǎn)組與對照組的比較無差別。
結(jié)論:
1.與正常妊娠相比,TET1,TE
17、T2,TET3 mRNA在流產(chǎn)組中表達量明顯降低,western-bloting和免疫組化的蛋白檢測方法同時證明了這種趨勢的存在。
2.我們成功的完成了絨毛組織中TET酶的Western-bloting和免疫組化實驗,進一步驗證了TET酶在人類早孕絨毛組織中是確實存在的,也就是說在早孕期間的母胎界面,存在著去甲基化的過程。在免疫組化的圖片上可以看到TET表達在滋養(yǎng)細胞的細胞漿內(nèi),無論是細胞滋養(yǎng)細胞還是合體滋養(yǎng)細胞,均可見TET
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