基于脂肪酶界面活化特性的固定化技術(shù).pdf

1、脂肪酶是一種非常重要的水解酶，大部分脂肪酶的活性部位上有一個(gè)“蓋子”的α-螺旋結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予它在油/水界面上表現(xiàn)出特殊的催化活性，“界面活性”。脂肪酶的這一特性與其“蓋子”的打開或閉合構(gòu)象密切相關(guān)?；谥久浮敖缑婊罨钡男阅埽{(diào)控載體材料的表面化學(xué)組成已成為研究脂肪酶固定化技術(shù)的重要手段。本文首先利用多種端基功能化聚苯乙烯載體，從載體表面親疏水性能研究脂肪酶的催化性能。其次，將生物表面活性劑膽汁鹽與脂肪酶（真菌類CRL，Candi

2、da rugosa和哺乳類PPL，Porcine pancreatic）共混，從催化活性、表面張力及氣/液界面C-H振動(dòng)信號(hào)來(lái)研究膽汁鹽濃度對(duì)脂肪酶界面吸附性能的影響?；谀懼}對(duì)脂肪酶的活化作用，分別研究了膽汁鹽濃度對(duì)兩類自由脂肪酶手性拆分能力的影響和膽汁鹽改性載體材料對(duì)固定化脂肪酶手性拆分能力的影響。最后，選擇LB膜固定化方法，考察膽汁鹽和載體對(duì)脂肪酶催化性能的影響，同時(shí)還設(shè)計(jì)控制辣根過(guò)氧化物酶（HRP）活性位取向的LB膜法進(jìn)行研究

3、。初步實(shí)現(xiàn)了從調(diào)控脂肪酶界面活化性能角度來(lái)設(shè)計(jì)脂肪酶固定化技術(shù)，具體的結(jié)論如下:
　　1.制備了帶不同功能基團(tuán)聚苯乙烯載體材料，載體表面接觸角為-COOH(68.4°)＜-OH(76.3°)＜NH2(80.1°)＜PS(87.7°)＜-CH3(98.9°)＜-CF3(99.6°)。脂肪酶吸附后的活性為-OH(92.78％)＞-NH2(76.22％)＞-COOH(20.03％)＞-CH3(2.64％)＞PS(1.91％)＞-CF3(

4、1.23％)。影響其催化性能的因素主要由載體對(duì)脂肪酶吸附量差異、脂肪酶底物及產(chǎn)物親和性差異及酶構(gòu)象的改變共同決定。脂肪酶在載體表面吸附量:-CF3(42.45 mg/m2)＞-CH3(28.67 mg/m2)＞PS(20.32mg/m2)＞-COOH(11.86 mg/m2)＞-NH2(3.96 mg/m2)＞-OH(3.11 mg/m2)。疏水載體對(duì)脂肪酶吸附能力明顯高于親水載體。此外，由SFG數(shù)據(jù)證實(shí)了在疏水端基改性PS表面，酶分子

5、構(gòu)象改變較大;而親水端基改性表面酶構(gòu)象保持較好。
　　2.膽汁鹽的濃度效應(yīng)對(duì)兩類脂肪酶的影響表現(xiàn)一致。在低脫氧膽酸鈉(NaDC)濃度下， NaDC與脂肪酶相互競(jìng)爭(zhēng)吸附，且部分脂肪酶被NaDC取代，SFG顯示仍有部分脂肪酶氨基酸殘基CH2伸縮振動(dòng)信號(hào)。而在高濃度下，NaDC逐漸取代脂肪酶，SFG譜圖只檢測(cè)到純NaDC甲基伸縮(2870 cm-1)及費(fèi)米共振(2945 cm-1)。在低NaDC(＜2mM)濃度下，膽汁鹽活化脂肪酶，由于

6、膽汁鹽誘導(dǎo)脂肪酶活性位上“蓋子”打開，暴露疏水殘基，表面張力達(dá)到最低值分別為CRL41.26 mN/m，PPL40.22mN/m。在高濃度下，過(guò)量NaDC分子完全占據(jù)脂質(zhì)界面，抑制脂肪酶吸附，從而導(dǎo)致酶活性下降。
　　3.苯乙醇手性拆分體系中，膽汁鹽(NaDC和NaC)低濃度下可提高脂肪酶水解活性， NaDC濃度在2mM-4mM間水解活性最大，NaC濃度在8mM左右最大，高濃度下有一定抑制作用。低濃度膽汁鹽對(duì)對(duì)映體過(guò)量值eep也有

7、一定提高，尤其是PPL，不加膽汁鹽對(duì)映體過(guò)量值eep約為60％，當(dāng)NaDC濃度為4mM時(shí)，eep值可達(dá)93％; NaC濃度為2mM時(shí)，eep值最高達(dá)73％。
　　4.制備不同親疏水改性聚丙烯腈表面，表面接觸角為(37.9°)＞PAN-NH2(58.0°)＞ PAN-CA(79.8°)＞PAN-DCA(82.5°)＞PAN(88.7°)。脂肪酶在疏水界面親和力更強(qiáng)，對(duì)于PPL，吸附量大小順序?yàn)镻AN(8.29mg/g)＞PAN-NH

8、2(6.17mg/g)＞PAN-DCA(4.83mg/g)＞PAN-CA(4.60mg/g)＞PAN-COOH(2.97mg/g);對(duì)于CRL，吸附量順序?yàn)?PAN(3.12mg/g)＞ PAN-NH2(2.54mg/g)＞PAN-CA(2.19mg/g)＞PAN-DCA(2.03 mg/g)＞ PAN-COOH(1.94mg/g)。脂肪酶固定在親水改性聚丙烯腈表面，采取蓋子閉合構(gòu)象，比活性較低，對(duì)映體過(guò)量值高;固定在疏水改性表面，采取