基于微環(huán)境調(diào)控的脂肪酶固定化方法的研究.pdf

1、脂肪酶(EC3.1.1.3)具有催化條件溫和、選擇性高和環(huán)境友好的特點(diǎn)，被廣泛用于綠色化學(xué)品的合成。通過固定化策略來增強(qiáng)酶的活性和穩(wěn)定性是現(xiàn)在脂肪酶在工業(yè)應(yīng)用中的一個重要手段，載體表面微環(huán)境也是近幾年研究的一個熱點(diǎn)。本文選擇彈性載體聚氨酯泡沫和大孔樹脂為載體，針對載體特性分別建立了基于微環(huán)境調(diào)控的脂肪酶固定化的新方法，通過微環(huán)境的調(diào)控提高固定化Yarrowialipolytica脂肪酶(YLIP2)的活力和穩(wěn)定性，并且研究了微環(huán)境的改變

2、和固定化酶的性能的關(guān)系。
　　 主要工作如下:
　　 1、采用0.2％的聚乙烯亞胺(PEI)涂層聚氨酯泡沫制備氨基化載體并固定化YLIP2。比較了PEI涂層載體4種不同的固定化方式，其中利用戊二醛活化后的共價固定化效果最好，并且固定化酶的活力與PEI的分子量和固定化方式相關(guān)，在PEI的分子量為70000Da時，固定化酶活比非氨基化的固定化酶提高了1.7倍。與游離酶和直接吸附固定化酶相比，PEI載體表面的固定化酶的穩(wěn)定性得

3、到了很大的提升。游離酶在50℃下緩沖液中處理30分鐘之后，保留活力只剩下不到最初的5％，而PEI固定化酶仍保留最初活力的70％，表明共價固定化酶對熱失活表現(xiàn)較好的抗性。圓二色譜分析也證明了PEI可以保護(hù)酶的二級結(jié)構(gòu)。紫外分光光度計和熒光光譜進(jìn)行了分析。另外，本文還通過掃描電鏡(SEM)、衰減全反射傅立葉變換紅外分析(ATR/FT-IR)和元素分析對載體改性前后的載體性質(zhì)進(jìn)行了研究。
　　 將固定化酶應(yīng)用于實(shí)際酯合成反應(yīng)體系。在有

4、機(jī)相中催化十二酸十二醇酯的合成，采用PEI涂層的共價固定化酶表現(xiàn)出良好的操作穩(wěn)定性。在連續(xù)使用30批之后，共價固定化酶催化合成的酯含量仍維持在88％。結(jié)合載體的彈性特征設(shè)計了相應(yīng)的新型反應(yīng)器的設(shè)計，該酶在催化合成棕櫚酸異辛酯表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，連續(xù)操作10批時，轉(zhuǎn)化率仍維持在90％。研究不僅證明了聚氨酯泡沫可以作為一種廉價和有效的酶固定化載體，同時也為通過載體的微環(huán)境設(shè)計提高固定化酶的活性和穩(wěn)定性提供了一個具體的實(shí)例。
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5、、以大孔樹脂為載體，研究了不同的微環(huán)境修飾技術(shù)，采用不同類型（二胺類、樹枝狀分子、蛋白類）、不同分子量大小的間臂分子對載體表面進(jìn)行修飾，改善固定化表面的微環(huán)境。通過不同改善方式得到的活力均有不同程度的提升，其中，明膠修飾后載體固定化酶的活力比未修飾的提高2倍，并且在連續(xù)使用35批后，轉(zhuǎn)化率仍有80％，獲得比未修飾的固定化酶更好的操作穩(wěn)定性。最后，還將此種固定化方法應(yīng)用在商業(yè)化載體Eupergit C2501上面，驗(yàn)證了這種固定化方法在不

6、同載體上的通用性。
　　 3、在前面研究基礎(chǔ)上，這里引入了混合模式的固定化方法對固定化酶微環(huán)境的影響。采用疏水的正丁胺和具有生物相容性的明膠同時對載體表面環(huán)境進(jìn)行改造，開發(fā)出一種高效的固定化YLIP2的方法，得到的酶活可以提高為修飾的至7倍，而單獨(dú)對載體進(jìn)行修飾時只可以提高2-2.5倍。說明了采用這種方法對載體表面微環(huán)境進(jìn)行改造是一個十分有力的手段。
　　 4、研究了添加劑對酶活的影響。分別對多種添加劑修飾載體和添加劑對