產(chǎn)殼聚糖酶細菌的篩選及其對綠豆和黃瓜立枯病的生物防治.pdf

1、本文的主要目的是分離篩選高產(chǎn)殼聚糖酶的微生物菌株，優(yōu)化產(chǎn)酶的發(fā)酵條件以及實現(xiàn)殼聚糖酶的純化和解析該酶的酶學特性，在此基礎上研究該菌株及其所產(chǎn)殼聚糖酶對兩種作物立枯的防治效果和可能的生防機制。 以殼聚糖為唯一碳源，通過透明圈法對100株植物內(nèi)生細菌進行篩選，根據(jù)菌株所產(chǎn)透明圈的直徑與菌落直徑的比值，獲得15株具有較好產(chǎn)酶能力的細菌。搖瓶液體培養(yǎng)復篩表明，K7菌株的酶活最高，酶活力為1.17 μmol/mL。通過生理生化實驗，結合菌

2、株形態(tài)特征觀察初步鑒定K7菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。 分別對K7菌株產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵過程中的溫度、培養(yǎng)時間、轉(zhuǎn)速和裝液量等參數(shù)進行了優(yōu)化，優(yōu)化結果顯示，在培養(yǎng)溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200 rpm條件下，菌株經(jīng)培養(yǎng)24 h后，以1﹪的接種量接入到100 mL LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 h，獲得最高的產(chǎn)酶活力，為17．41μmol/mL，是優(yōu)化前酶活力的14.90倍。 將K7菌株的發(fā)酵液離心后所得粗

3、酶液經(jīng)硫酸銨沉淀，使之達到80﹪的飽和度后，利用SephadexG-100柱層析進一步純化。獲得2種活性組分，將對應于第一個洗脫峰洗脫液合并，經(jīng)SDS-PAGE電泳后初步確定其分子量處于40KD-43KD之間。該酶對膠體殼聚糖、羧甲基纖維素(CMC)有降解能力，對膠體幾丁質(zhì)沒有降解能力。搖瓶培養(yǎng)表明，該菌殼聚糖酶的產(chǎn)生不需要殼聚糖誘導。K7菌株所產(chǎn)的殼聚糖酶作用于脫乙酰度90﹪的殼聚糖較好的反應條件是：最適pH值為5.6，最適溫度為55

4、℃，反應時間15 min。 對峙法測定了PDA平板上K7菌株及其殼聚糖酶對立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)抑制作用，發(fā)現(xiàn)K7菌株和殼聚糖酶都能夠直接抑制病菌的生長。植物活體上測定了K7菌株以及不同稀釋度的殼聚糖酶對綠豆和黃瓜兩種作物立枯病的防治效果，發(fā)現(xiàn)K7菌株可以有效降低病害的嚴重度，是一株具有應用潛力的生防菌株。同時發(fā)現(xiàn)，不同濃度的殼聚糖酶防治立枯病存在差異，一定范同內(nèi)隨著酶濃度的增大，防治效果提高。推測K