發(fā)育調(diào)控基因Pax2的克隆化及重組Pax2的真核表達.pdf

1、　　目的：本研究擬從人腎細胞癌組織中克隆全長配對盒基因(Pax2)，構(gòu)建hPax2高效真核表達載體，通過轉(zhuǎn)染腎細胞癌(RCC)患者外周血單核細胞(PBMCs)并經(jīng)誘導(dǎo)、培養(yǎng)獲得的未成熟DCs，制備hPax2/DCs疫苗，探討hPax2/DCs疫苗臨床應(yīng)用的可行性。　　方法：提取腎細胞癌組織總RNA，并以O(shè)ligo(DT)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；根據(jù)GeneBank中人Pax2mRNA全長開放讀框(M89470)，設(shè)計擴增人Pax2完整

2、開放讀框序列的PCR引物，分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點；PCR擴增目的基因hPax2；將回收純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，T4連接酶定向克隆入原核表達載體pTrcHis2B，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTrcHis2B-hPax2，切下目的基因片段，連接至真核表達載體pcDNA4/HisMax構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA4/HisMaxp-hPax2，經(jīng)酶切分析初步驗證后，DNA測序，確認hPax2全長開放讀框正確插入真核表達載體多克隆位點?！　?/p>

3、采集腎細胞癌患者血，分離PBMCs，以重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子、重組人白細胞介素-4和重組人腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到未成熟DCs和成熟DCs，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀(FCM)分析細胞表型；以復(fù)合陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)真核重組表達載體pcDNA4/HisMax-hPax2轉(zhuǎn)染未成熟DCs，反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染細胞hPax2基因的表達；應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包的Chi-Squaretest和One

4、-wayANOVA進行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05作為差別有顯著性標準。　　結(jié)論：本研究從人RCC組織中成功克隆了hPax2基因，并成功構(gòu)建其原核表達載體pTrcHis2B-hPax2和真核表達載體pcDNA4-HisMax/hPax2，為進一步闡明RCC發(fā)生的分子機制以及為RCC的基因和免疫治療奠定了基礎(chǔ)；同時在體外在不同條件下誘導(dǎo)、培養(yǎng)RCC患者外周血PBMCs，獲得了大量、不同免疫活性的DCs；真核表達載體pcDNA4-HisMax