1型多聚ADP核糖合成酶調節(jié)心血管系統(tǒng)相關基因轉錄的機制研究.pdf

1、心肌細胞,心肌成纖維細胞,平滑肌細胞和血管內皮細胞等心血管系統(tǒng)相關細胞在心肌缺血/再灌注損傷,各種原因引起的心力衰竭,心肌疾病,休克,心血管衰老,心肌肥大,動脈粥樣硬化以及血管損傷重塑等病理過程中會產生過量的活性氧族和活性氮族分子,被稱為氧化應激。這些活性氧/氮族分子在適量的情況下可作為信號分子參與細胞的正常生理過程。但過量的活性氧/氮族分子卻一方面可直接引起細胞功能障礙,另一方面通過激活其下游信號通路相關分子而影響細胞內基因的轉錄調控

2、進而影響蛋白質表達異常。蛋白質的異常表達是諸多心血管疾病發(fā)生發(fā)展乃至惡化的分子基礎。而尋找氧化應激下游相關信號通路分子作為干預靶點將為心血管疾病的治療提供新的途徑。
　　在真核細胞內普遍存在一類對蛋白質進行多聚ADP核糖化修飾的蛋白酶類家族。其中含量最為豐富的是1型多聚ADP核糖合成酶(poly(ADP-ribose) polymerase1,PARP-1),分子量約為113-116KDa,約占細胞內PARP酶活性的90％。PAR

3、P-1作為DNA損傷的感應器和信號分子,當它與斷裂的DNA結合后,酶的活性被激活,進而以NAD+作為催化底物,轉移其ADP核糖到受體蛋白(如組蛋白,轉錄因子和PARP-1自身等)。而被修飾的受體蛋白會發(fā)生結構和功能的改變。近年的研究發(fā)現PARP-1通過調控多種基因的轉錄調控在多種心血管疾病過程中發(fā)揮著重要的作用。在這些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中,PARP-1催化活性明顯增強,而在大量的心血管疾病動物模型中,給予PARP抑制劑處理后,可以發(fā)現P

4、ARP抑制劑發(fā)揮了明顯的積極有效的作用。本項研究將對PARP-1調節(jié)心血管相關基因的轉錄調控機制和PARP-1抑制劑的干預效果進行探討,并為PARP抑制劑的臨床研究提供理論和試驗依據。
　　第一部分PARP-1在人外周血單個核細胞中介導HSP70的表達的機制研究
　　目的:探討1型多聚ADP核糖合成酶(poly(ADP-ribose) polymerase-1,PARP-1)對炎性刺激物脂多糖(lipopolysacchar

5、ide,LPS)誘導人外周血單個核細胞熱休克蛋白70(HSP70)表達的調節(jié)作用及其機制
　　方法及結果:1.對培養(yǎng)的正常人外周血單個核細胞分別給予LPS刺激后,采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定培養(yǎng)上清中HSP70的表達水平。使用PARP-1抑制劑3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3AB)預處理細胞后,觀察3AB對LPS誘導的HSP70表達的影響。經LPS刺激后,HSP70的表達在不同時間點均顯著增高,與單純

6、LPS刺激組相比,PARP抑制劑3AB預處理細胞后HSP70的表達從18h開始逐漸降低,在24h和48h均顯著低于LPS刺激組2.提取培養(yǎng)細胞核蛋白,采用PARP活性檢測試劑盒測定培養(yǎng)細胞內PARP酶活性的變化。3AB顯著抑制了LPS刺激所致的PARP酶活性的增高。3.提取培養(yǎng)細胞核蛋白,采用凝膠遷移實驗(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)檢測核內轉錄因子熱休克因子(heat shock

7、 factor-1,HSF-1)的DNA結合能力,并觀察PARP-1抑制劑對HSF-1的DNA結合能力的影響。LPS刺激細胞后,HSF-1的DNA結合能力顯著增高;3AB預處理細胞后HSF的DNA結合能力明顯減弱。4.應用South-western技術檢測PARP-1重組蛋白與HSF-1重組蛋白作用后對后者DNA結合能力的影響。HSF-1重組蛋白在與PARP-1重組蛋白相互作用后,DNA結合能力明顯增強。5.應用Far-western技

8、術分別檢測PARP-1重組蛋白與HSF-1重組蛋白及細胞抽提物中HSF-1之間的相互作用。PARP-1重組蛋白能與HSF-1重組蛋白及細胞抽提物中HSF-1結合。
　　結論:在LPS誘導人外周血單個核細胞產生HSP70的過程中,PARP-1活性明顯增高。激活的PARP-1通過調節(jié)HSF的DNA結合能力調控了HSP70的表達。
　　第二部分 PARP-1在大鼠平滑肌細胞中參與調節(jié)TGFβ/Smad3信號通路的機制研究
　

9、　目的:探討大鼠平滑肌細胞中1型多聚ADP核糖合成酶(poly(ADP-ribose) polymerase-1,PARP-1)對TGF-β信號轉導通路中Smad3通路的作用。
　　方法及結果:在大鼠血管平滑肌細胞中,給予TGF-β1處理細胞后能通過誘導ROS的生成激活PARP-1。給以PARP抑制劑,3AB(3-aminobenzamide)或PJ34(N-(6-oxo-5,6-dihydrophenanthridin-2-yl

10、)-2-(N,N-dimethylamino)acetami),或者應用PARP-1 siRNA沉默PARP-1能抑制TGF-β1介導的Smad3的磷酸化和核聚集。在給予TGF-β1處理后,通過激活細胞核中PARP-1而促進Smad3的多聚ADP核糖化。對Smad3的多聚ADP核糖化修飾能增加Smad3-SBE復合物的形成,同時也增加Smad3的DNA結合能力。用3AB、PJ34或者PARP-1 siRNA預處理細胞后,能阻止TGF-β