MACC1基因沉默通過(guò)ERK通路對(duì)卵巢上皮性癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響.pdf

1、背景
　　作為一種嚴(yán)重威脅女性健康和生命的惡性腫瘤，卵巢癌死亡率居?jì)D科惡性腫瘤第一位。卵巢癌具有起病隱匿、發(fā)現(xiàn)晚、轉(zhuǎn)移早、進(jìn)展快及預(yù)后差的特點(diǎn)。目前卵巢癌的發(fā)病機(jī)理仍不十分清楚。由于卵巢居于盆腔底部，所以卵巢癌缺乏早期特異性癥狀，患者因腹脹等原因就診時(shí)約70％已是晚期。晚期卵巢上皮性癌行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的化學(xué)治療。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)旨在最大限度和范圍的切除腫瘤組織，但術(shù)后可能殘留的病灶仍然無(wú)法避免。因此，化療對(duì)晚期卵巢癌患

2、者來(lái)說(shuō)必不可少。但部分患者對(duì)化療藥物尤其一線(xiàn)藥物順鉑耐藥卻造成治療失敗?；熌退幱挚煞譃閮?nèi)在性耐藥和獲得性耐藥兩大類(lèi):約15％-25％的卵巢癌患者對(duì)以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案內(nèi)在性耐藥，即為原發(fā)耐藥;而至少80％的接受化療的患者在治療過(guò)程中逐漸對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性，稱(chēng)為獲得性耐藥，即為繼發(fā)性耐藥?；熌退巼?yán)重制約著卵巢癌患者的生活質(zhì)量和生存期。因此，近年來(lái)，科學(xué)研究者在不斷尋找改善患者化療敏感性的方法。
　　2009年，Stein等在

3、結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的基因，因其與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因而這個(gè)基因被稱(chēng)為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1(Metastasis-associatedincoloncancer-1，MACC1)。MACC1是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)/C-MET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上增強(qiáng)c-met的表達(dá)，在結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用。后來(lái)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)研究者在多種人類(lèi)惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了MAC

4、C1的高表達(dá)，比如肝細(xì)胞癌、膽囊癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，卵巢上皮性癌中MACC1mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于其在卵巢良性腫瘤及正常卵巢組織中的表達(dá);并合成了MACC1基因特異性shRNA，成功轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3，通過(guò)一系列功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后OVCAR-3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力減弱，而凋亡增加;通過(guò)RT-PCR和WesternBlot發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的C-met、p-ERK1/2、cyclinD1

5、、survivin、MMP9、MMP2及VEGFA等表達(dá)顯著減少，提示MACC1可能通過(guò)HGF/C-met信號(hào)通路及下游的MAPK通路來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)的一系列基因表達(dá)來(lái)參與卵巢癌的惡性進(jìn)展過(guò)程。但MACC1是否參與卵巢癌對(duì)順鉑敏感性的調(diào)節(jié)，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)顯示。
　　本研究通過(guò)RNA干擾(RNAinterferring，RNAi)技術(shù)分別抑制人上皮性卵巢癌細(xì)胞親本株SKOV3和相應(yīng)的順鉑耐藥株SKOV3/DDP細(xì)胞中MACC1表達(dá)

6、，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中MACC1基因的mRNA的表達(dá)情況，同時(shí)采用westernblot方法檢測(cè)MACC1、ERK1/2、p-ERK1/2、caspase-3及cleavedcaspase-3蛋白的表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖及順鉑敏感性變化，Transwell法研究細(xì)胞體外侵襲能力的變化，探討MACC1基因抑制對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響，以及MACC1基因抑制后ERK通路蛋白的變化，試圖進(jìn)一步了解MACC1是否通過(guò)ERK通

7、路對(duì)卵巢癌順鉑敏感性產(chǎn)生影響，并為尋求臨床上有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥提供新的思路。
　　目的
　　通過(guò)RNA干擾技術(shù)分別抑制SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中MACC1表達(dá)，分析MACC1基因抑制后卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡及順鉑敏感性的變化，分析MACC1影響卵巢癌上述生物學(xué)行為的分子機(jī)制，為臨床上逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥提供一個(gè)新的思路。
　　方法
　　1.前期設(shè)計(jì)的針對(duì)MACC1mRNA的小發(fā)卡狀RNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3

8、，RT-PCR及Westernblot分別檢測(cè)MACC1mRNA和蛋白表達(dá)，并檢測(cè)ERK1/2及p-ERK1/2蛋白含量的變化以及ERK通路抑制劑PD98059對(duì)上述蛋白水平的影響。MTT法評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)順鉑化療敏感性的變化。
　　2.前期設(shè)計(jì)的針對(duì)MACC1mRNA的小發(fā)卡狀RNA轉(zhuǎn)染卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP，RT-PCR及Westernblot檢測(cè)MACC1mRNA和蛋白表達(dá)，并檢測(cè)ERK1/2及p-ERK1/2、casp

9、ase-3及cleavedcaspase-3蛋白含量的變化以及ERK通路抑制劑PD98059對(duì)上述蛋白水平的影響。MTT法、FCM法和Transwell實(shí)驗(yàn)分別評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力和順鉑化療敏感性、凋亡的變化及細(xì)胞體外遷移能力的變化。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD法方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以

10、p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1.在SKOV3中，轉(zhuǎn)染MACC1shRNA的細(xì)胞可檢測(cè)到MACC1mRNA和蛋白的低表達(dá);p-ERK1/2表達(dá)明顯降低，細(xì)胞的順鉑半數(shù)抑制濃度(IC50)明顯低于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組。在此基礎(chǔ)上加入PD98059后p-ERK1/2表達(dá)及IC50改變更為明顯。
　　2.MACC1沉默的SKOV3/DDP細(xì)胞中，MACC1mRNA和蛋白表達(dá)降低，p-ERK1/2及cas