高血氨對肝細胞損傷和凋亡機制的研究.pdf

1、背景:肝臟是人體的內(nèi)最重要的器官之一，具有解毒、合成分解代謝、分泌、生物轉(zhuǎn)化以及免疫防御等功能，其血流量占心搏出量的30-40％，正常的肝臟能夠及時把血液中多余的、有害的物質(zhì)解毒或者滅活，并合成人體必需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，被譽為人體內(nèi)的“加工廠”，在生命活動中起著舉足輕重的作用。
　　血氨(BA)是氨基酸代謝的主要產(chǎn)物，主要來源于腸道產(chǎn)氨、腎臟泌氨、肌肉產(chǎn)氨等。過多的氨對人體的毒性很大，肝臟是氨的主要代謝場所，能及時將氨轉(zhuǎn)變成無毒或毒

2、性小的物質(zhì)排出體外，保持氨含量的平衡。
　　肝衰竭（HF）是由于各種原因造成肝細胞損壞引起肝臟功能障礙不能滿足身體需要而引起的一組臨床癥候群，是臨床常見的危急重癥之一，嚴重患者可引起肝性腦病、肝腎綜合征、出血等，死亡率高達70％～80％。其中血氨升高可能是引起肝衰竭一系列異常表現(xiàn)的重要原因之一。
　　然而血氨升高對機體細胞的毒性作用不是均等的，在相同濃度的血氨作用下，293、HDF、Vero和PQXB1/2細胞系較少受到生長

3、抑制或者不受到生長抑制，而McCoy、MDCK細胞系較多細胞受到生長抑制，但HeLa、BHK細胞系生長存在明顯的生長抑制，說明血氨對細胞的影響具有明顯細胞特異性。肝衰竭時血氨升高可以損傷神經(jīng)細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞導(dǎo)致肝性腦病的發(fā)生，高血氨對肝細胞的損傷和毒性作用尚不清楚。進一步研究高血氨在肝衰竭時對肝細胞損傷的作用及其機制具有重要的意義。
　　從2005到2011在該醫(yī)院觀察到在給予肝功能衰竭的患者降血氨治療時可以顯著減輕肝損傷，降低

4、患者的死亡率，改善患者的預(yù)后。建立慢性高氨誘發(fā)的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)肝臟的酶學(xué)指標均顯著增高。肝臟病理結(jié)果顯示高氨血癥可誘導(dǎo)肝細胞損傷，早期以細胞凋亡的表現(xiàn)為主，而炎癥細胞的浸潤、炎癥因子的表達和細胞壞死并不明顯，說明高血氨可能首先引起肝細胞凋亡進而參與肝損傷的進展從而在肝衰竭的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮進一步的肝細胞損傷作用。
　　目的:建立大鼠急性肝衰竭模型，并給予早期降血氨治療。研究早期降血氨后對肝細胞損傷和凋亡的影響。并通過觀察氯化氨對培

5、養(yǎng)大鼠肝細胞增值和凋亡的影響以及血氨對肝細胞線粒體功能及細胞內(nèi)鈣超載和細胞凋亡的影響及其相互關(guān)系，探討高血氨對肝細胞損傷的機制，為肝衰竭的進一步治療提供新的途徑和靶點。
　　方法:
　　動物實驗:
　　1.雌性SD大鼠48只，隨機分為3組:1，模型組，給予D-氨基半乳糖(450mg/kg)聯(lián)合內(nèi)毒素(100μg/kg)腹腔內(nèi)注射構(gòu)建急性肝衰竭模型，2，對照組以生理鹽水腹腔注射作為空白對照，3，OA干預(yù)組給藥同時加用門冬

6、氨酸鳥氨酸(1.5g/kg，間隔6h)腹腔內(nèi)注射。
　　2.分別于給藥后12h及24h麻醉處死動物，心臟采血并取肝臟組織。血液標本干化學(xué)法檢測血氨，ELISA檢測血清ALT、AST、TNF-α、IL-6;肝臟組織經(jīng)固定脫水石蠟包埋切片，HE染色觀察病理變化，TUNEL檢測細胞凋亡率;冰凍組織提取DNA，電泳觀察DNA Ladder，RT-PCR檢測P53及SPP1基因的相對表達量。
　　細胞學(xué)研究:
　　1.通過應(yīng)用氯

7、化氨(NH4Cl)對大鼠肝細胞進行處理，構(gòu)建高血氨細胞模型。
　　2.培養(yǎng)細胞隨機分為三組，分別應(yīng)用胞內(nèi)高效鈣選擇性螯合劑BAPTA-AM和胞外鈣選擇性螯合劑乙二醇二乙醚二胺四乙酸阻斷細胞內(nèi)或外的鈣離子，應(yīng)用MTT法檢測上述兩種干預(yù)方法和未干預(yù)組細胞的生長能力，檢測線粒體膜通道孔(MPTP)開放情況，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，并應(yīng)用Western blot法測定細胞色素C和PARP(poly ADP-ribose polymer

8、ase)DNA修復(fù)酶的表達情況。應(yīng)用熒光定量PCR法檢測鈣調(diào)蛋白(CALM)、鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶(CAMKⅡ)的RNA表達情況。ELISA法檢測CAMKⅡ的濃度。
　　結(jié)果:
　　動物實驗:
　　1.血氨檢測結(jié)果顯示大鼠血氨值12h達高峰，24h后下降，12h及24h肝衰模型組及OA干預(yù)組血氨值均較空白對照組明顯升高，OA干預(yù)組與肝衰模型組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.肝臟酶學(xué)相關(guān)指標(ALT，AS

9、T)隨著給藥時間延長明顯升高，除空白對照組外，24h組均高于12h組，12h OA干預(yù)組較肝衰模型組均值降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;24hOA干預(yù)組與肝衰竭模型組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，ALT、AST均與血氨值呈正相關(guān)。
　　3.肝組織病理改變隨著給藥時間延長逐漸加重，12h肝衰模型組與OA干預(yù)組未見明顯差別，24h OA干預(yù)組較肝衰模型組病變減輕，空白對照未見異常病變。除空白對照組外，其余各組均可見凋亡細胞特異的DNALa

10、dder。
　　4.TUNEL結(jié)果顯示:隨著給藥時間延長，肝衰模型組及OA干預(yù)組肝細胞凋亡率增加。肝衰模型組及OA干預(yù)組凋亡率較空白對照組明顯升高，OA干預(yù)組與肝衰模型組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，凋亡率與血氨值呈正相關(guān)。
　　5.IL-6、TNF-α、P53表達水平均隨著給藥時間增加(24h＞12h)，其中肝衰模型組及OA干預(yù)組與空白對照組相比均明顯升高，OA干預(yù)組與肝衰竭模型組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且其均與

11、血氨值呈正相關(guān)。
　　6.SPP1在急性肝衰大鼠模型高表達，隨著給藥時間延長，SPP1基因相對表達水平隨時間增加(24h＞12h)，其中肝衰模型組及OA干預(yù)組相對表達量與空白對照組相比均明顯升高;肝衰竭模型組與OA干預(yù)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義;SPP1與血氨值呈正相關(guān)。
　　細胞學(xué)研究:
　　1.MTT結(jié)果示:NH4Cl作用于鼠肝細胞后，隨時間延長和濃度增大，抑制率逐漸增加。EGTA+NH4Cl組（以下簡稱EGTA組）與

12、NH4Cl組無明顯差異;在高濃度時，BAPTA-AM組（以下簡稱BAPTA-AM組）較NH4Cl組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.流式細胞術(shù)結(jié)果示:NH4Cl作用于鼠肝細胞后，隨時間延長和濃度增大，凋亡細胞所占比率逐漸增加。BAPTA-AM組凋亡率較NH4Cl組和EGTA組降低，有統(tǒng)計學(xué)意義，NH4Cl組和EGTA組之間無差異。
　　3.Westem blot結(jié)果示: NH4Cl組和EGTA組在5.0mM以上氯化氨作用

13、72h后出現(xiàn)PARP蛋白被切割，BAPTA-AM組無變化;NH4Cl組和EGTA組Cyt C表達量有時間、濃度依賴性，而BAPTA-AM組的無差異。
　　4.線粒體通透轉(zhuǎn)運孔道(PTP)結(jié)果示:NH4Cl處理后，熒光峰值明顯左移，峰值左移隨時間延長而增加，BAPTA-AM組較NH4Cl組和EGTA組降低，有統(tǒng)計學(xué)意義，NH4Cl組和EGTA組之間無差異。
　　5.Real-time PCR結(jié)果示:在不同時間和不同濃度NH4C

14、l處理條件下，CAM的mRNA表達無差異，而CamK的mRNA隨NH4Cl濃度的增加而減少;相同濃度的NH4Cl的情況下，CamK的mRNA隨時間的延長而減少。
　　6.ELISA結(jié)果示:不同時間和不同濃度的NH4Cl處理細胞后CAMKⅡ無差異。
　　結(jié)論:
　　1.早期全程降血氨可降低肝細胞凋亡率，減輕肝損傷，并減少TNF-αt、IL-6、SPP1及凋亡相關(guān)基因P53的表達;
　　2.TNF-α、IL-6、SP