新生小鼠肝細(xì)胞高氧損傷及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：建立高氧肝細(xì)胞損傷模型，研究高氧對(duì)肝臟細(xì)胞增殖、凋亡的影響，初步探討其作用機(jī)制。
　　方法：原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)后分為：對(duì)照組（空氣組，Room Air，RA）、實(shí)驗(yàn)組（高氧組，Hyperoxia，HO）。對(duì)照組置于37℃、5％CO2環(huán)境培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組暴露于95%的氧氣中，37℃培養(yǎng)，分別干預(yù)0小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的觀察和檢測(cè)。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；CCK-8檢測(cè)

2、細(xì)胞的增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡變化；ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST、ALT含量；并通過(guò)western blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞內(nèi)Caspase3的表達(dá)量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2，Bax mRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞的形態(tài)變化.培養(yǎng)24小時(shí)后，對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形態(tài)正常，細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯改變；高氧組0h、3h、6h細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化與對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯變化。

3、12h后，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)部分漂浮，24h后，細(xì)胞出現(xiàn)大片空泡樣改變，懸浮細(xì)胞明顯增多。
　　2.肝細(xì)胞增殖.對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；高氧組隨著通氧時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞增殖明顯受到抑制。
　　3.ALT、AST結(jié)果.對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST含量在正常范圍；高氧組隨著高氧時(shí)間延長(zhǎng)，肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST含量逐漸增高。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè).流式檢測(cè)提示對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化；高氧組隨著高氧處理時(shí)

4、間的逐漸延長(zhǎng)，肝細(xì)胞凋亡率逐漸升高。
　　5.Caspase3表達(dá).對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)Caspase3的表達(dá)無(wú)明顯改變；高氧組隨著高氧處理時(shí)間的增加，可見(jiàn)Caspase3的表達(dá)量逐漸增高。
　　6.Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá).實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)量未見(jiàn)明顯異常；高氧組隨著高氧處理時(shí)間的延長(zhǎng)，可見(jiàn)Bax mRNA的表達(dá)量逐漸增高，Bcl-2 mRNA的表達(dá)量逐漸降低