肝細胞高膽固醇負荷活化未折疊蛋白應答介導細胞凋亡損傷的研究.pdf

1、資料顯示肝細胞膽固醇聚積可導致細胞損傷，為了探討膽固醇負荷時肝細胞損傷作用及可能機制，我們體外檢測了在膽固醇負荷條件下肝細胞的凋亡發(fā)生，未折疊蛋白應答活化，以及它們間的相關性。采用200μg/ml LDL或者200μg/ml LDL聯合20μg/ml 膽固醇酯化酶ACAT抑制劑58035孵育人正常肝L02細胞24h；采用膽固醇氧化酶-膽固醇酯酶法聯合高效液相色譜（HPLC）法檢測胞內總膽固醇（TC），游離膽固醇（FC）和膽固醇酯（CE）

2、的含量；RT-PCR分析UPR主要標志分子（BiP，XBP1，ATF6，ATF4，CHOP）基因mRNA表達水平；Western Blot檢測BiP，ATF6表達及活化caspase-3蛋白片段的表達變化；Annexin V-FITC-PI熒光標記染色觀察細胞凋亡；在LDL孵育的不同細胞組別中進一步添加3mM UPR抑制劑PBA，觀察細胞凋亡及活性caspase-3的表達變化。
　　 結果發(fā)現，與對照組相比：用LDL孵育的細胞內

3、膽固醇含量增加明顯，對照組細胞FC含量為5.90±0.36μg/mg，LDL組中FC為11.17±0.35μg/mg，LDL+58035組為13.20±0.66μg/mg；LDL組中伴侶分子BiP mRNA和蛋白表達水平明顯誘導上調，sXBP1和CHOP mRNA表達水平誘導增加，而LDL+58035組中它們的誘導表達增加更明顯，同時還誘導上調ATF4，ATF6的表達；對照組中細胞凋亡率為1.1±0.6%，而LDL組中活化的caspas

4、e-3增加到4.8±0.21倍，細胞凋亡率上升到12.9±1.4%，LDL+58035組中活化的caspase-3增加到8.4±0.46倍，細胞凋亡率達到21.3±2.4%。進一步在LDL孵育的組別中添加UPR抑制劑PBA后分別檢測細胞凋亡發(fā)生與活化caspase-3蛋白表達的變化，與對應的未加PBA的組別相比：LDL+PBA組和LDL+58035+PBA組中細胞凋亡率分別降至8.8±1.1%和14.9±1.6%，活化caspase-3