膿毒癥對(duì)肝細(xì)胞線粒體膜損傷機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)即感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)，是創(chuàng)傷、燒傷、休克、感染等臨床急危重癥患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是誘發(fā)膿毒性休克(septic shock)和多器官功能障礙綜合征(multipleorgan dysfunction syndrome，MODS)的重要原因，一直是危重病醫(yī)學(xué)所面臨的重大難題，疾病的死亡率高達(dá)50％以上。在過去10

2、年中，膿毒癥的發(fā)生率增加了91.3％，并還呈逐年上升的趨勢。由于膿毒癥來勢兇猛，病情進(jìn)展迅速，病死率高，是ICU患者最常見的死亡原因之一。目前，膿毒癥導(dǎo)致各組織器官功能障礙的病理生理學(xué)機(jī)制還不十分明確，因此深入探索膿毒癥的病理生理過程和發(fā)生機(jī)制，尋找新的治療方法，對(duì)于降低膿毒性休克的病死率具有重要價(jià)值。肝細(xì)胞線粒體是能量代謝的重要場所，在維持肝臟正常生命活動(dòng)中起著重要作用。肝細(xì)胞線粒體的雙層膜結(jié)構(gòu)參與呼吸鏈電子傳遞、三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝、血

3、氨代謝和尿素合成等，是維持肝臟正常功能的重要細(xì)胞器，肝臟線粒體膜功能的損傷可最終導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。本課題通過建立膿毒癥及膿毒性休克的動(dòng)物模型，觀察線粒體膜功能的變化及線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變，分析膿毒癥時(shí)肝細(xì)胞線粒體膜損傷的機(jī)制。這可能是膿毒癥致肝臟功能障礙的重要啟動(dòng)環(huán)節(jié)，也可能是膿毒癥誘發(fā)MODS的關(guān)鍵一環(huán)。 目的：通過提取膿毒癥兔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的肝細(xì)胞線粒體，檢測肝臟水腫程度、線粒體腫脹程度、線粒體膜電位和線粒體膜上的丙二醛(mal

4、ondialdehyde，MDA)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)酶的變化，并觀察肝細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變，來探討膿毒癥對(duì)肝細(xì)胞線粒體功能影響的可能機(jī)制，為指導(dǎo)膿毒癥的治療提供新的思路。 方法：將新西蘭兔36只，隨機(jī)分成3組：(1)正常對(duì)照組(n=12)：通過兔耳緣靜脈注射生理鹽水；(2)膿毒癥組(n=12)：通過兔耳緣靜脈注射大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)1

5、mg·kg-1；(3)膿毒性休克組(n=12)：通過兔耳緣靜脈注射2mg·kg-1。各組動(dòng)物均麻醉后分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈，經(jīng)頸總動(dòng)脈插管并連接壓力換能器，監(jiān)測平均動(dòng)脈壓、心率、呼吸頻率。當(dāng)膿毒癥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心率、呼吸增快20％，即達(dá)到膿毒癥標(biāo)準(zhǔn)后即處死；膿毒性休克組動(dòng)物平均動(dòng)脈壓下降20％以上，休克診斷成立后，立即處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)照組相同時(shí)間一并處死。處死后立即取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝臟，留取電鏡標(biāo)本，并取一定量肝臟組織采用干濕法測定肝臟組織水腫程

6、度。同時(shí)采用差速離心法迅速提取肝細(xì)胞線粒體超低溫保存，后經(jīng)比色法測定線粒體膜上的MDA值、ATP酶活力，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體腫脹程度及膜電位的變化。 結(jié)果： 1.膿毒癥和膿毒性休克模型的建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在靜脈注射LPS 1mg/kg后，其血壓無明顯變化，而心率和呼吸頻率逐漸加快，升高超過20％以上確立為膿毒癥模型；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在靜脈注射LPS 2mg/kg后，心率和呼吸頻率升高超過20％以上，同時(shí)檢測到平均動(dòng)脈壓下降20％以

7、上時(shí)確立為膿毒性休克模型。 2.膿毒癥時(shí)肝臟出現(xiàn)水腫，膿毒性休克時(shí)水腫程度加劇肉眼觀察見膿毒癥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟輕度水腫、顏色正常；膿毒性休克組動(dòng)物肝臟腫大明顯，顏色灰暗。肝臟水腫程度用干濕重法比較，以膿毒性休克組肝臟水腫程度最為顯著，膿毒癥組次之(P<0.05)。 3.膿毒癥組線粒體膜上MDA含量增大，膿毒性休克組更為顯著膿毒癥實(shí)驗(yàn)兔肝細(xì)胞線粒體膜上的MDA含量較對(duì)照組明顯增加，而膿毒性休克組中此項(xiàng)指標(biāo)含量上升更為明顯，各

8、組間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 4.膿毒癥時(shí)線粒體膜的數(shù)種ATP的活性均下降，膿毒性休克組下降幅度更大檢測肝細(xì)胞線粒體膜的Na+K+-ATP酶、Mg++-ATP酶、Ca++-ATP酶活性，膿毒癥時(shí)均減低，且這種減低在膿毒性休克組動(dòng)物中表現(xiàn)得更加明顯，各指標(biāo)組間變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。 5.膿毒癥組線粒體超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，膿毒性休克組改變更明顯電鏡下膿毒癥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝細(xì)胞線粒體腫脹，基質(zhì)濃縮，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)

9、張；膿毒性休克組可見肝細(xì)胞線粒體腫脹，且線粒體脊呈氣球樣變，排列混亂，線粒體膜增厚，并伴有大量脂滴聚集，細(xì)胞邊界模糊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂甚至消失。 6.膿毒癥時(shí)肝細(xì)胞線粒體水腫、跨膜電位減小，膿毒性休克時(shí)變化更加明顯應(yīng)用流式細(xì)胞儀測得，膿毒癥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反映肝細(xì)胞線粒體腫脹程度的前角散射(Forward Scatter,FSC)值增大，表示跨膜電位的側(cè)角散射(Side Scatter,SSC)值減小。這種變化同樣出現(xiàn)在膿毒性休

10、克組，且該組變化較膿毒癥組更加明顯，兩組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 結(jié)論： 通過對(duì)LPS制備的兔膿毒癥及膿毒性休克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)LPS可能通過使肝細(xì)胞線粒體膜脂質(zhì)過氧化、抑制膜表面ATP酶活性、降低跨膜電位、改變膜的通透性，致使線粒體腫脹、變性、功能喪失直至最終凋亡，由此導(dǎo)致肝細(xì)胞功能障礙。以上研究結(jié)果為今后探明膿毒癥的病理生理過程，探尋膿毒癥致肝損傷的機(jī)制，尋求膿毒癥致肝損傷新的預(yù)防和治療手