高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷繼發(fā)影響間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病是一組由多種病因引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病患者體內(nèi)長(zhǎng)期的高血糖最終會(huì)導(dǎo)致一系列大血管和微血管病變并引發(fā)并發(fā)癥，如糖尿病心肌病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病周圍神經(jīng)病、糖尿病足等，這些并發(fā)癥嚴(yán)重地影響患者的生活質(zhì)量，并與糖尿病較高的致殘率和致死率有關(guān)。目前對(duì)于糖尿病的治療，主要目標(biāo)是控制血糖和改善胰島素不足和胰島素抵抗，但這些治療手段并不能有效地阻止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，臨床上仍缺乏針對(duì)糖尿病并發(fā)癥的特效治療

2、方式。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)移植是近年來涌現(xiàn)出的治療糖尿病并發(fā)癥的新方式。MSC是一類幾乎存在于機(jī)體所有組織和器官中的多能干細(xì)胞，他具有強(qiáng)大的增殖能力和向中胚層組織分化的能力，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)和修復(fù)受損組織中都發(fā)揮了非常重要的作用。大量研究顯示，對(duì)多種糖尿病大血管和微血管并發(fā)癥應(yīng)用MSC移植治療都取得了很好的治療效果，然而也有一部分糖尿病患者對(duì)MSC移植并不敏感，治療效果不佳

3、。且有研究發(fā)現(xiàn)，移植到糖尿病患者體內(nèi)的MSC極易死亡，其機(jī)制仍不清楚。另外，較同齡健康人相比，晚期糖尿病患者的內(nèi)源性MSC的數(shù)量和質(zhì)量也呈下降趨勢(shì)。
　　研究證實(shí)，糖尿病患者體內(nèi)持續(xù)性的高血糖通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生鈣超載和氧化應(yīng)激等一系列病理改變，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，增殖和遷移能力下降導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂是糖尿病血管病變所致各種并發(fā)癥的主要原因。而前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖不僅不抑制MSC的生長(zhǎng)，反而促進(jìn)其增殖。所以，推測(cè)高糖首先誘

4、導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并釋放相關(guān)因子后繼發(fā)性導(dǎo)致了內(nèi)源性或者外源性MSC在糖尿病患者體內(nèi)的死亡。
　　為此，本研究旨在探討體外高糖誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞損傷而繼發(fā)性影響MSC增殖和凋亡的效應(yīng)及其分子機(jī)制。為尋找增強(qiáng)MSC移植治療糖尿病并發(fā)癥以及保護(hù)糖尿病患者內(nèi)源性MSC的新策略提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　通過酶消化法體外分離培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、組織塊貼壁法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并對(duì)其表面標(biāo)志和功能進(jìn)行鑒定。檢測(cè)高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)

5、胞功能的影響，建立高糖損傷內(nèi)皮細(xì)胞的模型，并收集內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基。然后用收集到的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基刺激MSC，檢測(cè)其對(duì)MSC增殖和凋亡的影響，并通過Western blot鑒定刺激后的MSC中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，鈣離子染色檢測(cè)刺激后的MSC中鈣離子濃度的變化。
　　結(jié)果:
　　1.成功的在體外分離培養(yǎng)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，其表面標(biāo)志和功能特點(diǎn)符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.成功構(gòu)建了高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷

6、的模型，流式細(xì)胞術(shù)及體外成血管實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，損傷其血管生成能力。并成功收集到不同培養(yǎng)條件的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
　　3.細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明高糖刺激的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基能抑制MSC的增殖，并促進(jìn)其凋亡;Western blot表明MSC的凋亡與凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、Cl-Caspase-3)的表達(dá)水平變化有關(guān);鈣離了染色提示MSC的凋亡與鈣離子內(nèi)流導(dǎo)致的鈣超載有關(guān)。
　　結(jié)論: