microRNAs在α-黑素細胞刺激素抑制巨噬細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α中的作用.pdf

1、神經(jīng)、內分泌、免疫三大系統(tǒng)相互聯(lián)系,相互制約,構成復雜的神經(jīng)內分泌免疫網(wǎng)絡(NEI),在整體水平調節(jié)、維持機體的正常生理機能。內源性神經(jīng)免疫調節(jié)肽α-黑素細胞刺激素(α-MSH)能夠通過結合黑皮質素受體(MCRs)作用于免疫系統(tǒng)的不同細胞,或下調致炎因子的產(chǎn)生或抑制致炎因子的作用,產(chǎn)生抗炎和免疫調節(jié)效應；也可以通過結合中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達的MCRs下行調控炎癥反應。α-MSH在多種實驗性炎癥動物模型中已顯示有明顯的抗炎效應,但其作用機制尚

2、未闡明。
　　 在細菌脂多糖(LPS)的致炎生物學效應中,IKK/IKB/NF-κB-(NF-κB)通路和Raf-1/MEK1-MEK2/ERK1-ERK2(ERK)通路是其誘導單核巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α的重要信號通路。在NF-κB通路中,IKK扮演了非常重要的角色,盡管上游信號路徑不同,但是最終都匯集到IKK。其中,IKKβ亞基在催化IκB蛋白磷酸化以及調節(jié)經(jīng)典、非經(jīng)典NF-κB活化通路中發(fā)揮重要作用,IKKβ被認為是IKK復

3、合酶體的一個重要亞基。在ERK通路中,激活的Raf-1能夠繼續(xù)活化其下游的絲裂素活化蛋白激酶激酶(MEK)、絲裂素活化蛋白激酶(MAPK),進一步激活下游轉錄調節(jié)因子,促進TNF-α的產(chǎn)生。ERK通路還能偶聯(lián)NF-κB信號通路:當ERK通路下游的S6激酶(p90)被激活后,能夠使IκBα的Tyr殘基磷酸化降解,NF-κB被釋放入核,促進TNF-α的產(chǎn)生。
　　 微小RNA(microRNA)是一類18-23個核苷酸組成的非編碼蛋

4、白質的單鏈小RNA分子,能夠通過結合靶基因的mRNA而發(fā)揮轉錄后調節(jié)的功能。研究表明,microRNA影響著幾乎所有的信號通路,參與多種生理病理過程,包括發(fā)育、分化、凋亡、脂肪代謝、病毒感染和癌癥等。深入地研究microRNA的發(fā)生、作用機理和功能,將會揭示這些生物過程乃至一些疑難疾病的分子基礎。盡管已有研究表明α-MSH能夠通過調節(jié)PKA、P38激酶、IκBα等直接或間接地調控上述兩條信號通路,從而抑制TNF-α等致炎因子的表達,發(fā)揮

5、抗炎作用,但α-MSH是否通過影響micmRNA的水平進而調控這兩條信號通路的研究未見報道。因此,我們通過如下實驗著重探討了在LPS刺激下和加α-MSH處理后相關microRNA的變化及其調節(jié)IKKβ和Raf-1表達進而調控這兩條信號通路的機制。
　　 第一部分α-MSH抑制THP-1細胞產(chǎn)生TNF-α的產(chǎn)生并上調hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表達
　　 在第一部分實驗中,我們采用人單核細胞系THP-

6、1細胞,分別加入5×10-8mol/Lα-MSH、50 ng/ml LPS、5×10-8 mol/Lα-MSH+50 ng/ml LPS刺激(即α-MSH組、LPS組和α-MSH+LPS組),另設未進行處理的對照組(control組),用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定TNF—α的分泌水平,用Real-Time qPCR檢測TNF-αmRNA的相對表達量。ELISA結果顯示:α-MSH+LPS組產(chǎn)生TNF-α的水平顯著低于LPS組(P

7、<0.01),Real-Time qPCR的結果也表明:α-MSH+LPS組TNF-α的mRNA表達量顯著低于LPS組(P<0.01),說明α-MSH能夠抑制LPS誘導的TNF-α產(chǎn)生。
　　 我們進一步通過targetscans、MiRBase等microRNAs靶標預測方法預測到hsa-miR-15b和hsa-miR-199a能夠分別作用于Raf-1、IKKβ的3‘UTR區(qū)。為探明在THP-1中是否存在hsa-miR-15b

8、和hsa-miR-199a以及α-MSH、LPS對這兩種microRNAs的影響,同上所述設立control組、α-MSH組、LPS組和α-MSH+LPS組,采用Real-Time qPCR分別檢測四組細胞中hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的相對表達量。結果顯示:THP-1細胞中存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a；α-MSH能夠上調二者的表達(與control組比較,P<0.01),LPS則抑制二者的表

9、達(與control組比較,P<0.01)；同時,hsa-miR-15b和hsa-miR-199a在α-MSH+LPS組的相對表達量都顯著高于LPS組(P<0.01),說明α-MSH能夠促進hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表達,拮抗LPS對二者表達的抑制作用。
　　 第二部分α-MSH抑制巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α并上調hsa-mir-15b和hsa—mir-199a的表達
　　 上述結果表明在非正常人單核

10、細胞(THP-1)來源的巨噬細胞中存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a,并且α-MSH和LPS均能影響二者的表達。在第二部分實驗中,我們進一步研究了正常人外周血來源的單核巨噬細胞中是否也存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a,以及α-MSH、LPS對二者表達的影響。首先用不同濃度LPS(0、1、10、100、1000 ng/ml)作用于人單核巨噬細胞6 h,以確定LPS誘導TNF-α產(chǎn)生的量效關系；然后設立

11、不同時間點(0、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h)檢測LPS(20 ng/ml)刺激細胞產(chǎn)生TNF-α的量,以明確時效關系。接著研究了不同濃度α-MSH(10-13、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8 mol/L)對LPS(20 ng/ml)誘導TNF-α產(chǎn)生的影響,以確定α-MSH的最佳濃度。ELISA結果顯示:在不同濃度LPS刺激下,單核巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α隨LPS濃度的增加而

12、增加,其中以1000 ng/ml LPS刺激作用最強,說明人單核巨噬細胞TNF-α的合成對LPS的刺激呈劑量依賴性:在LPS(20 ng/ml)刺激45 min后開始產(chǎn)生TNF-α,在2 h-6 h內顯著上升,8 h后TNF-α產(chǎn)生相對平緩,但仍能保持較高濃度；α-MSH(10-12 mol/L)即可抑制LPS(20 ng/ml)作用于人單核巨噬細胞2 h誘導的TNF-α的產(chǎn)生,其中α-MSH(10-8 mol/L)的抑制效果最強。

13、r>　　 用Real-Time qPCR檢測正常人外周血來源的單核巨噬細胞中hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表達,觀察α-MSH、LPS作用下隨時間(15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h)不同二者的變化規(guī)律。結果顯示:單核巨噬細胞中亦存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a；α-MSH組的hsa-miR-15b在15 min-8 h之間一直呈上升趨勢,hsa-miR-199a在4 h

14、時達到高峰后逐漸下降;LPS組的hsa-miR-15b和hsa-miR-199a則一直呈下降趨勢；α-MSH+LPS組的hsa-miR-199a在加入LPS刺激4 h前一直呈上升趨勢,在4 h后逐漸下降;hsa-miR-15b和hsa-miR-199a在α-MSH+LPS組中的變化趨勢與其在α-MSH組中的變化趨勢一致,但相對表達量低于α-MSH組。
　　 為探明α-MSH、LPS以及α-MSH+LPS刺激下hsa-miR-15

15、b和hsa-miR-199a的預測靶標Raf-1和IKKβ的表達是否發(fā)生相應變化,我們采用Real-Time qPCR和Western blotting檢測了細胞受不同刺激后Raf-1和IKKβ的mRNA和蛋白表達水平。Real-Time qPCR結果顯示:α-MSH能夠抑制Raf-1mRNA的表達(與control組比較,P<0.01),但對IKKβ mRNA的表達無明顯影響；LPS則上調Raf-1和IKKβmRNA的表達(與cont

16、rol組比較,P<0.01),同時,α-MSH+LPS組Raf-1 mRNA顯著低于LPS組(P<0.05),說明α-MSH能夠拮抗LPS對Raf-1 mRNA的上調,抑制其表達。Western blotting結果顯示:α-MSH能夠抑制Raf-1蛋白表達,但對IKKβ蛋白表達無影響；LPS則能夠上調Raf-1和IKKβ蛋白的表達。
　　 上述結果表明:在正常人外周血來源的單核巨噬細胞中存在hsa-miR-199a和hsa-m

17、iR-15b；α-MSH和LPS在不同時間均能影響二者的表達:另外,α-MSH僅能下調Raf-1mRNA和蛋白的表達,對IKKβ無顯著影響,LPS則能上調Raf-1、IKKβ mRNA和蛋白的表達。
　　 第三部分 Hsa-miR-15b和hsa-miR-199a靶標的驗證和對LPS誘導巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α的影響
　　 為進一步驗證IKKβ、Raf-1是否分別為hsa-miR-199a和hsa-miR-15b的靶基因,

18、我們先將hsa.miR.15b、hsa.miR-199a的mimics、mimics control、inhibitor、inhibitor control分別轉染正常人外周血單核巨噬細胞,即為mimics組、mimicscontrol組、inhibitor組、inhibitor control組。通過Western blotting檢測Raf-1、IKKβ的蛋白表達變化,通過Real-Time qPCR檢測Raf-1、IKKβ的mRN

19、A表達量。然后,將Raf-1和IKKβ的3’UTR區(qū)分別構建到熒光報告基因質粒載體,將hsa-miR-15b和Raf-13’UTR熒光報告基因質粒以及hsa-miR-199a和IKKβ的3’UTR熒光報告基因質粒分別共轉入293T細胞,通過雙熒光報告素酶檢測系統(tǒng)檢測hsa-miR-15b和hsa-miR-199a是否分別作用于Raf-13’UTR區(qū)和IKKβ的3’UTR區(qū)。
　　 Western blotting結果顯示:hsa

20、-miR-15b和hsa-miR-199a的mimics能夠分別抑制Raf-1和IKKβ的蛋白表達(與mimics control組比較),hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的inhibitor則分別促進Raf-1和IKKβ的蛋白表達(與inhibitor control組比較)；Real-Time qPCR結果顯示:hsa-miR-15b的mimics能夠抑制Raf-1的mRNA表達(hsa-miR-15b mimics

21、與mimics control組比較,P<0.01)；hsa-miR-15binhibitor則促進Raf-1 mRNA表達(hsa-miR-15b inhibitor與inhibitor control組比較,P<0.01),但hsa-miR-199a mimics和inhibitor對IKKβ mRNA的影響并不明顯,說明hsa-miR-199a僅抑制IKKβ的翻譯,而不影響IKKβ的轉錄。雙熒光報告素酶檢測系統(tǒng)檢測結果表明:hsa

22、-miR-15b和hsa-miR-199a能夠分別作用于Raf-13’UTR區(qū)和IKKβ的3’UTR區(qū)。上述結果表明:Raf-1和IKKβ分別是hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的靶標,并且,hsa-miR-15b能通過降低Raf-1的mRNA水平而抑制Raf-1的表達；hsa-miR-199a僅在翻譯水平上抑制IKKβ。
　　 為進一步研究hsa-miR-15b、hsa-miR-199a對LPS誘導的TNF-α的

23、影響,我們將hsa-miR-15b、hsa-miR-199a的mimics、inhibitor分別轉染人外周血單核巨噬細胞,實驗分組:mimics control組、hsa-miR-15b mimics組、hsa-miR-199a mimics組、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a mimics組以及inhibitor control組、hsa-miR-15binhibitor組、hsa-miR-199a inhibito

24、r組、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a inhibitor組。然后加入LPS刺激4 h,ELISA檢測上清TNF-α,Real-Time qPCR檢測TNF-αmRNA。
　　 ELISA結果顯示:hsa-miR-15b mimics組、hsa-miR-199a mimics組、hsa-miR-15b+hsa—miR-199a mimics組的TNF-α分泌量均顯著低于mimics control組(與mimic

25、s control比較,hsa-miR-15b mimics組P<0.05,hsa-miR-199a mimics組P<0.05,hsa-miR-15b+hsa-miR-199a mimics組P<0.01)；hsa-miR-15b inhibitor組、hsa-miR-199a inhibitor組、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a inhibitor組的TNF-α分泌量均顯著高于inhibitor control組(

26、與inhibitor control組比較,各組P<0.05)；Real-Time qPCR結果也表明:hsa-miR-15b mimics組、hsa-miR-199a mimics、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a組的TNF-α mRNA的表達量均顯著低于mimics control組(與mimics control組比較,各組P<0.01),hsa-miR-15b inhibitor組、hsa-miR-199ainh

27、ibitor組、hsa—miR-15b+hsa-miR-199a inhibitor組的TNF-α mRNA的表達量均顯著高于inhibitor control組(與inhibitor control組比較,各組P<0.01),說明hsa-miR-15b、hsa-miR-199a能夠抑制TNF-α mRNA和蛋白的表達。
　　 綜上所述,通過本課題的研究發(fā)現(xiàn),在THP-1細胞和正常人外周血來源的單核巨噬細胞中均存在hsa-miR

28、-15b和hsa-miR-199a；α-MSH能夠上調hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表達,LPS則抑制二者的表達；α-MSH通過上調hsa-miR-15b抑制ERK通路中的關鍵組分Raf-1的表達,抑制LPS誘導的TNF-α產(chǎn)生；LPS則通過下調hsa-miR-15b和hsa-miR-199a,促進IKKβ、Raf-1的表達,從而促進TNF-α的產(chǎn)生。本研究從microRNA調控層面初步揭示了α-MSH的抗炎作用機制