腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8在胃腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、目的:
　　胃癌(gastric cancer，GC)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全球范圍內(nèi)發(fā)病率第四位，死亡率第二位的腫瘤。在中國(guó)，居消化道惡性腫瘤發(fā)病率、死亡率首位。胃癌大多發(fā)病隱匿、惡性程度高、病情發(fā)展較迅速且容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，盡管隨著醫(yī)療水平不斷提高，在早期診斷及綜合治療方而取得了巨大進(jìn)步，但手術(shù)切除依然是目前治愈胃癌的唯一手段。胃癌在不同區(qū)域間發(fā)病率變化較大，這與胃癌危險(xiǎn)因素的分布息息相關(guān)。胃癌的危險(xiǎn)因素主要包括:幽

2、門螺桿菌感染、不良的生活習(xí)慣（吸煙、飲酒、煙熏鹽漬食物等）、慢性萎縮性胃炎及胃潰瘍等。胃癌的早期診斷率仍不足10％，中晚期胃癌預(yù)后很差。胃癌包括多種病理類型，其中胃腺癌占到了胃癌總數(shù)的90％，是本課題組的主要研究對(duì)象。胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是多因素、多階段、多基因參與的，研究參與此過程的易感基因以及相關(guān)細(xì)胞因子必定有助于了解胃癌的生物學(xué)行為和判定評(píng)估患者的預(yù)后。尋求有利于早期診斷、治療及評(píng)價(jià)預(yù)后的有效生物學(xué)靶標(biāo)是當(dāng)前胃癌研究的重要內(nèi)容之

3、一。
　　腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白(tumor necrosis factor-alpha-inducedprotein，TNFAIP)家族，是由腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factora，TNFα)誘導(dǎo)產(chǎn)生的，通過NF-κ B的激活而發(fā)揮作用，參與多種生物學(xué)過程。TNFAIP8家族蛋白屬于此家族中新發(fā)現(xiàn)的一類，包括TIPE(TNFAIP8)，TIPE1(TNFAIP8L1)，TIPE2(TNFAIP8L2)和T1

4、PE3(TNFAIP8L3)。其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域(death effecter domain，DED)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、調(diào)亡、炎癥發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，在人類多種實(shí)體腫瘤中，TNFAIP8過表達(dá)能加速細(xì)胞增殖，從而促使腫瘤生長(zhǎng);沉默TNFAIP8基因后，腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)明顯減弱。認(rèn)為TNFAIP8的表達(dá)與其發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后有明顯的相關(guān)性。由此可見，TNFAIP8在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)

5、移過程中可能起關(guān)鍵作用。
　　但是，有關(guān)TNFAIP8在我國(guó)高發(fā)疾病胃癌中的相關(guān)研究報(bào)道較少，特別是目前國(guó)內(nèi)外尚沒有關(guān)于TNFAIP8的表達(dá)情況與臨床病理特征包括腫瘤標(biāo)志物血清CA72-4及預(yù)后關(guān)系的研究。同時(shí)TNFAIP8在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中是如何發(fā)揮作用的機(jī)制尚不明確。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TNFAIP8在胃腺癌原發(fā)灶、癌旁正常胃粘膜組織及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況，并詳細(xì)分析其表達(dá)水平與臨床病理特征包括預(yù)后的關(guān)系。進(jìn)一

6、步采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，合成TNFAIP8基因小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染干擾胃癌細(xì)胞，觀察TNFAIP8 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響，并分析探討TNFAIP8參與侵襲、轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.TNFAIP8在胃腺癌中的表達(dá)情況:選取山東省醫(yī)科院附院病理科存檔的106例胃腺癌原發(fā)灶及癌旁正常胃粘膜組

7、織和相應(yīng)60例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，這106例患者的臨場(chǎng)資料也被統(tǒng)計(jì)。應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)TNFAIP8表達(dá)，分析TNFAIP8表達(dá)水平與胃腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。生存分析方法評(píng)價(jià)TNFAIP8表達(dá)對(duì)胃腺癌患者預(yù)后的影響。
　　2.TNFAIP8基因的干擾RNA體外合成及對(duì)胃癌細(xì)胞系的干預(yù):使用Western Blot方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞株SGC7901、MGC803、BGC823中TNFAIP8基因的表達(dá)量，篩選出TNFAIP8基因表達(dá)

8、量最高的細(xì)胞系，合成TNFAIP8基因的干擾RNA(TNFAIP8 siRNA1、TNFAIP8 siRNA2、TNFAIP8 siRNA3)，并利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將三組干擾RNA分別轉(zhuǎn)染進(jìn)該胃癌細(xì)胞株，應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot方法檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后的TNFAIP8 mRNA和蛋白的表達(dá)，評(píng)價(jià)干擾效果。
　　3.TNFAIP8對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制探討:篩選出沉默效率最

9、高的一組序列，采用平板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞單克隆形成能力，CCK-8的方法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化，采用Transwell小室方法分別檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力及轉(zhuǎn)移能力的變化，采用Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞TNFAIP8基因轉(zhuǎn)染前后胃癌相關(guān)基因（MMP-2、MMP-9）在蛋白水平上的表達(dá)變化，探討TNFAIP8促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.TNFAIP8在癌旁相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、胃腺癌原發(fā)灶、和正常胃粘膜組

10、織中高表達(dá)率依次下降，分別為81.7％(49/60)，47.2％(50/106)和0，三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩兩比較也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移原發(fā)灶的高表達(dá)率60.0％(36/60)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶30.4(14/46)，兩者比較也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　2.TNFAIP8表達(dá)與血管侵犯，TNM分期，T分級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及外周血血清CA72-4水平呈正相關(guān)。
　　3.Kapla

11、n-Meier方法生存分析結(jié)果顯示TNFAIP8表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，TNFAIP8高表達(dá)的胃腺癌患者總生存率低于TNFAIP8低表達(dá)的患者。Cox多因素分析結(jié)果表明TNFAIP8表達(dá)水平是胃腺癌患者獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志(RR1.736，P=0.029)。
　　4.小干擾RNA轉(zhuǎn)染:使用Western Blot方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞株SGC7901、MGC803、BGC823中TNFAIP8基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)SGC7901中TNFAIP8基因的

12、表達(dá)量最高。通過轉(zhuǎn)染試劑HiperFect分別將TNFAIP8 siRNA1、TNFAIP8 siRNA2、TNFAIP8 siRNA3和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞SGC7901，結(jié)果TNFAIP8siRNA2組的沉默效率最高，轉(zhuǎn)染干擾序列后，TNFAIP8基因在RNA水平和蛋白水平的表達(dá)明顯下降。
　　5.TNFAIP8對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制探討:胃癌細(xì)胞SGC7901在干擾后，腫瘤細(xì)胞的單克隆形成能力、細(xì)胞增殖能

13、力、遷移能力和侵襲能力均明顯下降，胃癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9在蛋白水平表達(dá)均下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.TNFAIP8在胃腺癌中高表達(dá)，TNFAIP8在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)率高于原發(fā)灶。研究TNFAIP8在胃腺癌中表達(dá)很有價(jià)值。
　　2.TNFAIP8的表達(dá)水平與胃腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，TNFAIP8對(duì)判斷胃腺癌患者的預(yù)后有意義，亦可能成為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。
　　3.TNFAIP8 si