中國(guó)南海和南極菲爾德斯半島海域沉積物中微生物、蛋白酶的多樣性及有機(jī)氮的降解機(jī)制.pdf

1、地球表面的70％被海洋所覆蓋，海洋沉積物構(gòu)成了最復(fù)雜的微生物生境，其中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，據(jù)統(tǒng)計(jì)，地球上總的微生物中，位于深海沉積物中的超過(guò)50％。深海（除熱液口外）和極地海洋是一個(gè)高鹽、低溫的極端環(huán)境，微生物在這種極端環(huán)境條件下生存，必須進(jìn)化出獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制，因而這些微生物在物種、基因組成和生態(tài)功能上具有多樣性。研究海洋沉積物中的微生物的多樣性對(duì)闡述全球的生物地球化學(xué)循環(huán)是十分關(guān)鍵的。
　　 沉積物中有機(jī)氮的降解是海洋生態(tài)

2、系統(tǒng)氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。在海洋中，生物合成的高分子量有機(jī)氮（High-Molecular-Weight Organic Nitrogen，HMWON）以顆粒有機(jī)氮(particulate organic nitrogen，PON)的形式，從海水表層沉降到沉積物中。PON在微生物的作用下降解為高分子量的溶解有機(jī)氮(dissolved organic nitrogen，DON)，DON再經(jīng)過(guò)微生物的分解、氨化、硝化和反硝化作用，最終完成整個(gè)氮

3、循環(huán)，微生物在整個(gè)過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，其中硝化反應(yīng)是氮循環(huán)的限速反應(yīng)，該步驟的關(guān)鍵酶是氨單加氧酶，編碼該酶的基因?yàn)閍mo，編碼該酶α亞基的基因amoA經(jīng)常被用作研究亞硝化類(lèi)群的分子標(biāo)記。因此，海洋沉積物中PON的降解在沉積物整個(gè)氮循環(huán)過(guò)程中具有非常關(guān)鍵的作用，蛋白質(zhì)是沉積物中PON和DON的重要組成部分，因此產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌在他們的降解過(guò)程中起重要作用。對(duì)海洋沉積物中微生物、蛋白酶的研究和amoA基因多樣性的研究對(duì)于最終闡明沉積物中氮的循

4、環(huán)機(jī)制和開(kāi)發(fā)新型蛋白酶具有重要的意義。
　　 本論文分別對(duì)中國(guó)南海的8個(gè)沉積物樣品和中國(guó)南極長(zhǎng)城站附近海域的8個(gè)沉積物樣品的微生物多樣性、所產(chǎn)蛋白酶多樣性以及長(zhǎng)城站附近沉積物樣品中的amoA基因多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并分析了中國(guó)南海沉積物菌株Bacillus sp.CF12-9分泌的蛋白酶Ba-1的酶學(xué)性質(zhì)。
　　 一、中國(guó)南海沉積物中產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌和蛋白酶的多樣性
　　 用酪蛋白明膠培養(yǎng)基，從中國(guó)南海水深154-

5、2，456 m不等的8個(gè)海洋沉積物樣品中篩選產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌菌株。根據(jù)平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)，沉積物中可培養(yǎng)的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的豐度大約為106個(gè)/g，表明在沉積物里存在著大量的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌?？偣埠Y選得到不同的菌株78株，對(duì)這些菌株16S rDNA序列進(jìn)行測(cè)序，并提交至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為FJ169962-FJ170039。序列分析表明，除了兩株菌屬于Firmicutes（厚壁菌門(mén)）的Bacillus屬，另外的76株均屬于

6、Gammaproteobacteria綱的Pseudoalteromonas、Alteromonas、Marinobacter、Idiomarina、Halomonas、 Vibrio、Shewanella、Pseudomonas或Rheinheimera屬。其中Alteromonas屬(34.6％)和Pseudoalteromonas(28.2％)屬為優(yōu)勢(shì)屬。其余的屬分別占了所有菌株的2.6％到7.7％。并且還發(fā)現(xiàn)，在不同位點(diǎn)和不同水

7、深的沉積物里的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌是不同的。在最淺的位點(diǎn)E505，主要的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌屬是Shewanella，占該位點(diǎn)所有菌株數(shù)的60％，而在所有超過(guò)1000m深的沉積物樣品中，主要的產(chǎn)蛋白酶菌為Pseudoalteromonas和Alteromonas。針對(duì)篩選到的Gammaproteobacteria菌株，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)里搜索相近菌16S rRNA基因序列，結(jié)果顯示，菌株與GenBank中最為接近的16S rRNA序列大部分來(lái)自沒(méi)有命

8、名的菌株或者未培養(yǎng)的海洋細(xì)菌。有一些菌株，如CF12-14、E505-2、E505-8和E407-8，與其他的已經(jīng)鑒定的細(xì)菌種有著非常遠(yuǎn)的進(jìn)化距離，這些菌株可能是一些新種。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的研究，CF12-14和E407-8已經(jīng)分別被鑒定為Idiomarina屬和Rheinheimera屬的新種。
　　 有62株菌能夠產(chǎn)生足夠量的酶用于進(jìn)行蛋白酶抑制劑實(shí)驗(yàn)。分析絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)，金屬蛋白酶抑制劑鄰菲羅啉(o-

9、phenanthroline，O-P)，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64和天冬氨酸蛋白酶抑制劑pepstatin A對(duì)這些菌株產(chǎn)的蛋白酶活性的抑制效果。結(jié)果顯示，PMSF對(duì)所有研究菌株產(chǎn)的蛋白酶的活性都有抑制作用，抑制率為23-100％，表明這些菌株都能夠產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶。O-P對(duì)47株菌產(chǎn)生的蛋白酶的活性有抑制作用，抑制率為20-84％，表明這些菌株都能夠產(chǎn)生金屬蛋白酶。大部分菌株產(chǎn)生的胞外蛋白酶的活性能夠同時(shí)被PMSF和O-P抑制，表明

10、了這些菌株能夠同時(shí)產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。E-64和pepstatin A對(duì)菌株產(chǎn)的蛋白酶活性的最高抑制率低于10％，或者無(wú)抑制，這表明這些菌株不產(chǎn)或者產(chǎn)極其少量的半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。因此，海洋沉積物中細(xì)菌產(chǎn)的胞外蛋白酶可能都是絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。另外，研究了這些菌株產(chǎn)的胞外蛋白酶對(duì)酪蛋白、明膠和彈性蛋白的降解能力。結(jié)果表明，有68株菌能夠在酪蛋白或者明膠平板上產(chǎn)生明顯的水解圈，這些蛋白酶對(duì)酪蛋白和明膠的降解能力

11、明顯不同。僅有47株菌能夠在彈性蛋白平板上產(chǎn)生較為顯著的水解圈。有一些菌株產(chǎn)的蛋白酶對(duì)三種蛋白均有較高的降解活力，比如菌株CF6-2、CF6-14、E505-3、CF12-10和E407-8。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)seudoalteromonas sp.CF6-2分泌的蛋白酶Pseudoalterin是一個(gè)序列新穎的M23家族金屬蛋白酶。以上結(jié)果表明，這些菌株產(chǎn)的蛋白酶可能屬于不同種類(lèi)的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，其中存在著一些新型的蛋白酶

12、。
　　 二、南極菲爾德斯半島海域沉積物的微生物多樣性
　　 我們采集了中國(guó)南極長(zhǎng)城站附近Maxwell灣海洋沉積物樣品，利用qPCR技術(shù)對(duì)沉積物中的細(xì)菌及古菌的16S rDNA及amoA基因序列進(jìn)行了定量分析，并利用454焦磷酸測(cè)序?qū)Τ练e物中的微生物群落進(jìn)行了分析。
　　 沉積物中，細(xì)菌16SrDNA的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)古菌的，說(shuō)明了細(xì)菌在采集的海洋沉積物樣品中的優(yōu)勢(shì)地位。對(duì)8個(gè)樣品中的細(xì)菌和古菌的16S rDNA序

13、列進(jìn)行測(cè)序，總共得到了181231條細(xì)菌16S rDNA和95118條古菌16S rDNA序列，提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為SRP017144。在8個(gè)樣品的群落里，細(xì)菌和古菌的OTU數(shù)量分別為2516-4278和403-1221個(gè)，該結(jié)果和Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均表明了在所有樣品的群落中，細(xì)菌的多樣性高于古菌的多樣性。Good'scoverage指數(shù)顯示，測(cè)序得到的序列包含了細(xì)菌類(lèi)群總數(shù)的87.6％-92.5％

14、和古菌類(lèi)群總數(shù)的94.2％-98.8％。在沉積物樣品中總共發(fā)現(xiàn)了23個(gè)細(xì)菌門(mén)和2個(gè)古菌門(mén)。其中，細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為Firmicutes和Proteobacteria，分別占了所有序列的61.3％和17.9％，在所有的8個(gè)樣品中均出現(xiàn)的共有17個(gè)科或類(lèi)群，這些類(lèi)群總計(jì)占了每個(gè)樣品細(xì)菌群落的92％以上。在所有的樣品的古菌群落里，均發(fā)現(xiàn)了泉古菌(Crenarchaeota)和廣古菌（Euryarchaeota），除了樣品SS9，沉積物中最多的古

15、菌是廣古菌。Methanomicrobia(40.2％)、Halobacteria(27.7％)、Group C3(12.1％)和Marine Benthic GroupB(11.4％)是主要的古菌類(lèi)群。值得注意的是，有大量的序列不能歸入任何一個(gè)目(order)，尤其是在SS8、SS9和SS13樣品中，該比例分別達(dá)到38.6％、70.1％、45.8％，說(shuō)明在南極沉積物中有著大量新的類(lèi)群。細(xì)菌和古菌的Weighted UniFrac PC

16、oA分析表現(xiàn)出了極其不同的樣式，表明沉積物中的細(xì)菌和古菌群落可能受不同因素的影響。
　　 細(xì)菌amoA基因拷貝數(shù)比細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)低4-5個(gè)數(shù)量級(jí)，古菌的amoA基因則未能擴(kuò)增到目的片段，說(shuō)明沉積物中氨氧化細(xì)菌所占比例較少，而氨氧化古菌更少，以致qPCR定量方法檢測(cè)不到，這與454焦磷酸測(cè)序的分析結(jié)果是一致的。構(gòu)建了細(xì)菌amoA基因的克隆文庫(kù)，總計(jì)得到了85條序列，分為8個(gè)OTU，其中三個(gè)較大的OTU總計(jì)有78條序

17、列。搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，樣品中檢測(cè)到的氨氧化細(xì)菌的amoA基因均與Nitrosomonadaceae科關(guān)系較近，表明樣品中氨氧化細(xì)菌的多樣性較低。
　　 三、南極菲爾德斯半島海域沉積物中產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌及蛋白酶的多樣性
　　 從南極菲爾德斯半島海域沉積物樣品中篩選到了203個(gè)不同的菌株，對(duì)這些菌株的16S rDNA序列測(cè)序，得到的序列提交至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為:KC160632-KC1

18、60834。其中有98株能夠在酪蛋白明膠篩選平板上生長(zhǎng)，但是不能形成水解圈，另外105株細(xì)菌能夠形成水解圈，用于后續(xù)分析。105株細(xì)菌分別屬于23個(gè)屬，其中5株細(xì)菌——菌株SS9.12、SS9.38、SS14.29、SS14.30和SS14.31，它們?cè)谶M(jìn)化樹(shù)上聚為一簇，并且在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有關(guān)系相近的Bacteroidetes屬，這可能代表了Bacteroidetes門(mén)下一個(gè)較新的分類(lèi)單元。
　　 在屬的水平上，每個(gè)樣品中

19、的細(xì)菌都表現(xiàn)出較高的多樣性。這些細(xì)菌屬于Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria和Proteobacteria四個(gè)門(mén)。總體來(lái)說(shuō)，Bacillus(22.9％)、Flavobacterium(21.0％)和Lacinutrix(16.2％)是優(yōu)勢(shì)屬，幾乎在每個(gè)樣品中均有發(fā)現(xiàn)，并且形成了豐度最大的類(lèi)群，這三個(gè)屬總共有63株，占了總數(shù)的60％。有14個(gè)屬只有一個(gè)菌株，占到了全部菌株的16.2％。并且，結(jié)果

20、顯示，在不同的樣品里產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群是不同的。
　　 多達(dá)85株菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)酶量低，不能進(jìn)行蛋白酶的抑制劑實(shí)驗(yàn)，其余20株細(xì)菌的蛋白酶抑制劑實(shí)驗(yàn)表明沉積物中的細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶均為絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。這個(gè)結(jié)果與南海沉積物樣品的是一致的。篩選到的105株細(xì)菌中57株細(xì)菌只能形成微弱的水解圈，只有48株能夠在篩選平板上形成明顯水解圈，它們對(duì)酪蛋白和明膠的降解能力展現(xiàn)出了極大的不同，表明這些菌株產(chǎn)的蛋白酶可能屬于不

21、同種類(lèi)的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。綜上所述，南極沉積物中的細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶的能力與南海沉積物中的相比較低。
　　 四、菌株Bacillus sp.CF12-9產(chǎn)的胞外蛋白酶Ba-1的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究
　　 Bacillus sp.CF12-9是從南海沉積物中分離到的一株高產(chǎn)蛋白酶的菌株。蛋白底物固體平板分析表明，該菌株對(duì)酪蛋白、明膠和彈性蛋白都有較強(qiáng)的降解能力。我們通過(guò)液體發(fā)酵，收集發(fā)酵液，并利用陰離子交換層析的方法，

22、分離純化了菌株Bacillus sp.CF12-9產(chǎn)的一個(gè)胞外蛋白酶Ba-1。底物特異性分析顯示，該酶對(duì)不同的蛋白質(zhì)底物如酪蛋白、明膠、膠原蛋白和彈性蛋白均有降解活性，該酶的最適酶活溫度為30℃，在0℃時(shí)，仍然能保持35％左右的活性，表明該酶為典型的適冷蛋白酶，該酶的最適pH為8.5。蛋白酶抑制劑實(shí)驗(yàn)表明該酶屬于絲氨酸蛋白酶。2mM的K+或Li+能抑制該酶約20％的活性，2mM的Zn2+能夠抑制該酶活性的30％左右，2mM的Fe2+能夠

23、明顯的抑制該酶的酶活，抑制率在80％以上。該酶在無(wú)NaCl時(shí)酶活最高，0.5 M的NaCl即能抑制該酶活性的20％，說(shuō)明該酶對(duì)NaCl的耐受性較差。對(duì)Ba-1進(jìn)行N端測(cè)序，獲得了該蛋白酶N端前15個(gè)氨基酸殘基序列:WTPNDYYYQGYQYGP，將得到的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，初步確定蛋白酶Ba-1屬于絲氨酸蛋白酶subtilisin家族(S8A)。根據(jù)N端序列，設(shè)計(jì)兼并引物為正向引物，使用S8A家族保守區(qū)引物RM6為反

24、向引物，擴(kuò)增得到了Ba-1編碼基因的N端到保守區(qū)的片段，利用TAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到Ba-1的基因序列，全長(zhǎng)為1215 bp，編碼了404個(gè)氨基酸，分析顯示，M1-A27為信號(hào)肽，E55-T124為I9 peptidase inhibitor，W125-Y404為成熟酶。與該蛋白酶氨基酸序列相似度最高的為B.sp.Ak.1產(chǎn)的蛋白酶Ak.1 protease和Geobacillus stearothermophilus產(chǎn)的胞外蛋白酶

25、，相似度高達(dá)72％，Ak.1 protease和Geobacillus stearothermophilus產(chǎn)的蛋白酶均在60-70℃保持穩(wěn)定，并且是熱激活蛋白，而B(niǎo)a-1在35℃保溫30 min幾乎喪失所有的活性。因此，Ba-1與這兩個(gè)酶的性質(zhì)差別很大。以上結(jié)果為進(jìn)一步闡述蛋白酶在深海氮循環(huán)中發(fā)揮的作用提供了有力的理論依據(jù)，并且該酶作為典型適冷酶在需要低溫催化的領(lǐng)域可能有一定的應(yīng)用前景。
　　 本論文使用高通量測(cè)序的方法研究了