肽核酸靶向抑制線粒體融合逆轉(zhuǎn)人肺腺癌干細(xì)胞順鉑耐藥的研究.pdf

1、目前，肺癌發(fā)病率及死亡率逐年遞增，成為嚴(yán)重威脅人們健康的惡性腫瘤之一。其中，肺腺癌發(fā)病率迅速增加，已取代鱗癌成為最常見(jiàn)的病理類型。雖然化療仍然是治療肺癌的重要手段之一，但目前化療效果仍非常有限?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，肺癌干細(xì)胞的存在是導(dǎo)致肺癌患者化療耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因。線粒體是調(diào)控細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，是一個(gè)形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分布不斷動(dòng)態(tài)變化的器官，通過(guò)精細(xì)調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)、外膜的融合和分裂，滿足細(xì)胞內(nèi)各區(qū)域的能量需要、維持mtDNA穩(wěn)定、保護(hù)細(xì)

2、胞器結(jié)構(gòu)完整。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞中的線粒體較其余癌細(xì)胞具有更活躍的融合現(xiàn)象，有助于肺癌干細(xì)胞抗凋亡，有可能成為臨床中真正意義上的靶點(diǎn)。因此尋求靶向抑制肺癌干細(xì)胞線粒體融合，逆轉(zhuǎn)肺腺癌干細(xì)胞順鉑耐藥，提高患者生存率，具有重要的臨床意義。然而對(duì)于肺癌干細(xì)胞線粒體融合現(xiàn)象的研究尚處于空缺階段，因此，本研究旨在觀察肺癌干細(xì)胞線粒體融合現(xiàn)象且利用肽核酸靶向抑制肺癌干細(xì)胞線粒體融合，比較其抑制后的順鉑耐藥情況，以期為肺癌干細(xì)胞的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

3、。
　　目的：
　　1.觀察肺癌干細(xì)胞線粒體融合相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　2.觀察肺癌干細(xì)胞線粒體能量代謝的生物學(xué)特性。
　　3.探討肽核酸靶向抑制肺癌干細(xì)胞線粒體融合的影響。
　　方法：采用腫瘤干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（serum-free medium，SFM）的方法將A549細(xì)胞誘導(dǎo)成具有干性的A549細(xì)胞球體，采用RT-PCR和Western-blot技術(shù)分別檢測(cè)A549細(xì)胞及A549細(xì)胞球線粒體促融合蛋白M

4、itofusin1、Mitofusin2、Opa1和Atad3a的mRNA和蛋白的表達(dá)；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞及A549細(xì)胞球線粒體膜電位；采用激光共聚焦觀察A549細(xì)胞及A549細(xì)胞球線粒體空間分布；固相肽合成法合成肽核酸－三苯磷復(fù)合物；激光共聚焦觀察肽核酸－三苯磷復(fù)合物對(duì)肺癌干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和鑒定；采用RT-PCR和Western-blot技術(shù)分別檢測(cè)肽核酸－三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染肺癌干細(xì)胞后干擾 mtDNA基因表達(dá)情況；Wester

5、n-blot技術(shù)檢測(cè)線粒體融合相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)肽核酸－三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞球及A549細(xì)胞后ATP含量的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位指標(biāo)。
　　結(jié)果：A549細(xì)胞球中線粒體促融合蛋白Mfn1、Mfn22、Opa1和Atad3a分子的mRNA和蛋白的表達(dá)均較A549細(xì)胞明顯升高；A549細(xì)胞球中線粒體繞核分布且線粒體膜電位較A549普通細(xì)胞高；肽核酸－三苯磷復(fù)合物作用于A549細(xì)胞球及A549細(xì)

6、胞線粒體融合后，線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1蛋白的表達(dá)均下降，而Atad3a的表達(dá)則無(wú)明顯變化，同時(shí)伴有2組細(xì)胞ATP含量的明顯下降；A549細(xì)胞球凋亡率較 A549細(xì)胞明顯升高，而線粒體膜電位則明顯下降。
　　結(jié)論：1. A549肺癌細(xì)胞球的線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1、Atad3a的蛋白和mRNA表達(dá)較A549細(xì)胞明顯升高。
　　2.肽核酸-三苯磷復(fù)合物積聚于高ψm的A549肺癌細(xì)胞球