奧美拉唑逆轉(zhuǎn)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549-DDP耐藥性研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)研究V-ATPase非特異性抑制劑—奧美拉唑逆轉(zhuǎn)人肺腺癌耐藥株A549/DDP細(xì)胞耐藥性作用及可能機(jī)制。
　　 方法:選用人肺腺癌耐藥株A549/DDP為研究對(duì)象,采用MTT法測(cè)定順鉑(DDP)對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50),以此判斷A549/DDP細(xì)胞的耐藥性情況。采用MTT法確定奧美拉唑(Omerprazole,簡(jiǎn)稱(chēng)OME)非細(xì)胞毒性劑量:取低于10％抑制濃度(inhibiting c

2、oncentration,IC10)作為藥物作用濃度:OME4μg/ml。在此濃度逆轉(zhuǎn)劑作用下測(cè)定順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50),以此判斷OME對(duì)耐藥細(xì)胞藥物敏感性的影響。光學(xué)顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。運(yùn)用流式細(xì)胞儀(Flow cytometry,FCM)測(cè)定加入逆轉(zhuǎn)劑后對(duì)A549/DDP細(xì)胞株的細(xì)胞周期影響。運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)有無(wú)逆轉(zhuǎn)劑作用下A549/DDP細(xì)胞中Bcl-2和PTEN蛋白表達(dá)的情況。應(yīng)用激光掃描共

3、聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy,LSCM)檢測(cè)OME處理前后細(xì)胞內(nèi)BCECF-AM(pH探針)熒光強(qiáng)度的變化,間接反映細(xì)胞內(nèi)pH之變化。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse TranscriptionPolymemse Chain Reaction,RT-PCR)檢測(cè)V-ATPase mRNA在人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞和耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP中表達(dá)情況。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚

4、合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)有無(wú)逆轉(zhuǎn)劑作用下A549/DDP細(xì)胞中Bcl-2 mRNA和PTEN mRNA表達(dá)的情況。
　　 結(jié)果:MTT法測(cè)定DDP對(duì)A549細(xì)胞的IC50為1.9μg/ml,DDP對(duì)A549/DDP細(xì)胞的IC50為43.4μg/ml。OME對(duì)A549/DDP細(xì)胞的IC10為8.7μg/ml。選取非細(xì)胞毒作用濃度為4μg/ml的OME為逆轉(zhuǎn)劑,在經(jīng)逆轉(zhuǎn)劑預(yù)處理24h情況下,DDP對(duì)A549/DDP細(xì)胞的IC50由43.41μ

5、g/ml降至30.1μg/ml,逆轉(zhuǎn)倍數(shù)約為1.44,與無(wú)逆轉(zhuǎn)劑組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。光鏡下顯示,空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)為梭形或多形性,形態(tài)飽滿(mǎn),胞體折光性好,其增殖快速,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增大,邊緣模糊,胞體折光性減弱。細(xì)胞可變圓脫壁,部分細(xì)胞脹大破裂。高倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞明顯破碎,培養(yǎng)液中可見(jiàn)到大量細(xì)胞碎片。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明經(jīng)OME預(yù)處理后細(xì)胞周期受到影響,G1期細(xì)胞明顯增多,S期細(xì)胞則相對(duì)減少,與無(wú)逆轉(zhuǎn)劑組相比具

6、有顯著性差異(P＜0.01)。其中實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中OME對(duì)細(xì)胞周期的影響可能主要以阻滯A549/DDP細(xì)胞于G1期為主。流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入OME逆轉(zhuǎn)劑組與未加逆轉(zhuǎn)劑組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)由1降至0.8,PTEN蛋白表達(dá)由1升至1.02。二者各自相比均具有顯著性差異(P＜0.01)。激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)OME處理后細(xì)胞內(nèi)BCECF-AM(pH探針)綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),間接反映OME處理后細(xì)胞內(nèi)pH明顯減低。RT-PCR結(jié)果顯示V-A

7、TPase在A(yíng)549及A549/DDP中相對(duì)表達(dá)量分別為0.88和0.99,二者相比具有顯著性差異(P＜0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示V-ATPase在有無(wú)OME逆轉(zhuǎn)劑處理情況下的相對(duì)表達(dá)量分別為1.05和1.09,二者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示在加入OME逆轉(zhuǎn)劑預(yù)處理24h與未OME逆轉(zhuǎn)劑處理情況下兩組A549/DDP中Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量由0.9降至0.8,二者相比具有顯著性差異(P＜0.01);PT

8、EN的相對(duì)表達(dá)量由0.25升至0.29,二者相比具有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:1、本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明了V-ATPase在人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP較人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中表達(dá)增多,為以V-ATPase為作用靶點(diǎn)的而進(jìn)行逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥開(kāi)辟了一條極具潛力的有效途徑。2、本實(shí)驗(yàn)表明,通過(guò)非細(xì)胞毒濃度的OME預(yù)處理24小時(shí)后,可以使A549/DDP細(xì)胞停滯于G1期,并可抑制人肺腺癌耐藥株A549/DDP增