專一性脫硫菌LY822的分離篩選及脫硫基因工程菌的構建.pdf

1、專一性微生物脫硫技術能選擇地性脫除加氫脫硫技術難以脫除的芳香族含硫化合物，是實現(xiàn)石油及其產品深度脫硫有效的技術之一。分離篩選優(yōu)良的菌株，構建高效的脫硫工程菌是提高微生物脫硫能力的重要途徑。本文以此為研究目標，開展了專一性脫硫菌株的分離鑒定、脫硫基因克隆、啟動子功能鑒定、表達載體和工程菌的構建以及脫硫活性評估等方面的研究。 采用以二苯并噻吩(DBT)為唯一硫源的培養(yǎng)基，經馴化培養(yǎng)，從我國山東勝利油田土樣中分離到一株專一性脫硫菌株L

2、Y822。對該菌培養(yǎng)五天后的代謝產物高效液相色譜(HPLC)分析的結果表明，0.5mmol/L的DBT完全轉化為2-羥基聯(lián)苯(2-HBP)，證明該菌株是“4S途徑”的專一性脫硫菌。菌株形態(tài)特征及16SrDNA序列分析表明，該菌屬于紅球菌屬進化分枝，與紅平紅球菌Rhodococcuserythropolis同源性最高，達到99.7％，故將該菌初步鑒定為Rhodococcussp.LY822。以LY822菌的質粒DNA為模板，PCR反應擴增

3、了三個脫硫結構基因片段dszA、dszB和dszC，大小分別為1.3kb、1.0kb和1.2kb。利用表達質粒pET21a分別克隆了三個脫硫基因，并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達，全細胞蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn)有相應的清晰融合蛋白條帶產生。 以帶有報告基因gfp的質粒pEGH和大腸桿菌-紅球菌穿梭載體pBS305為出發(fā)質粒，構建了三個帶有不同啟動子的表達質粒pBSGt、pBSGd和pBSGk，電擊轉化紅平紅球菌LY822。激光共

4、聚焦顯微鏡檢測結果表明，當gfp基因受tsr(硫鏈絲菌肽抗性基因)啟動子調控時，gfp基因的表達效率最高，而且不再受硫酸鹽的抑制。 以紅平紅球菌LY822的質粒為模板，擴增了脫硫基因的全片段，連接于經HindⅢ-XbaⅠ酶切的pBSGd，pBSGk，pBSGt，得到帶有脫硫基因的表達載體pBSDd、pBSDt和pBSDk。分別電擊轉化LY822菌和吖啶橙消除質粒的LY-0菌，脫硫活性測定結果表明，tsr啟動子調控的工程菌株LYD