納米金復合探針結合基因芯片在鑒別結核分枝桿菌中的應用.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，簡稱結核桿菌)引起的經(jīng)呼吸道傳播的全身性慢性傳染病，其在全球廣泛流行，嚴重危害人類健康，已成為全球重大公共衛(wèi)生問題和社會問題。因此，建立快速、高效、特異的檢測結核分枝桿菌新方法勢在必行。
　　 近幾年來，核酸檢測中應用納米金顆粒替代目前通用的熒光、同位素等信號分子已比較普遍。大量實驗表明，納米金復合探針因具有穩(wěn)定性高、標記密度高和雜交效率高等特點而廣泛

2、用于核酸檢測。因此，本研究將納米技術與基因芯片技術有機結合在一起，在此基礎上建立了兩種目視化核酸檢測新方法，即基因芯片膜轉印檢測法與基因芯片交聯(lián)放大銀染檢測法，為分子生物學領域提供了快速、簡便、高靈敏度的檢測病原細菌新方法。
　　 本實驗室采用經(jīng)典檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備納米金顆粒?；诩{米金顆粒與疏基修飾的寡核苷酸共價結合作用及與蛋白分子的吸附作用，我們構建了不同種類的納米金復合探針，并且通過透射電子顯微鏡(TEM)和紫外吸

3、收光譜對納米金顆粒及納米金復合探針進行形貌觀察和表征分析。
　　 本研究首先利用堿基互補配對原則使納米金復合探針與靶DNA分子在芯片表面形成央心復合結構，再用膜轉印法或銀染法將芯片上不易觀察的結果信號轉化成易檢測信號，最后通過普通光學掃描儀讀取信號結果或肉眼直接判讀信號有無來判斷靶DNA的有無。
　　 結果：表明，透射電子顯微鏡觀察所制備的納米金顆粒，其粒徑為(13±2)nm，形貌呈球形，大小均勻，分散良好；制備的納米金

4、復合探針形態(tài)完好，分散均勻，穩(wěn)定性好。通過紫外分光光度計在521nm處的吸光度計算出所制備納米金溶液的濃度為12.5 nmol/L。當納米金顆粒表面信號探針與檢測探針摩爾比為10:1，兩種信號探針(T10，T40)摩爾比為9:1時，運用基因芯片膜轉印檢測法肉眼可檢測0.23pmol/L的結核分枝桿菌16S rDNA PCR擴增產物或l pmol/L的合成靶DNA分子。在優(yōu)化交聯(lián)納米金復合探針使用量和銀染增強時間條件下，基因芯片交聯(lián)放大銀

5、染檢測法可肉眼檢測10 fmnol/L，的合成靶DNA。
　　 以上實驗結果顯示，運用納米金復合探針結合基因芯片技術的兩種核酸檢測新方法，具有操作簡單，靈敏度高，特異性好和無需特殊儀器設備等特點。通過運用納米金復合探針不僅利于雜交反應，而且通過標記不同的標記物，將基因芯片上不易檢測的結果信號轉化為可目視化檢測的信號。因此，基因芯片膜轉印檢測法與基因芯片交聯(lián)放大銀染檢測法均是較好的結核分枝桿菌檢測新方法，在生物分子檢測方面具有較高