結(jié)核分枝桿菌抗原的制備及其在診斷中的應(yīng)用.pdf

1、目的：目前結(jié)核病的檢測方法多種多樣，免疫學(xué)檢測方面主要包括基于細(xì)胞免疫的檢測方法和基于體液免疫的檢測方法。基于細(xì)胞免疫的檢測包括皮膚試驗和細(xì)胞因子的檢測。基于體液免疫的檢測包括抗原檢測和抗體檢測。免疫學(xué)檢測獲得較高敏感性和特異性的關(guān)鍵在于抗原的選擇，選擇出特異性好，敏感性高的結(jié)核分枝桿菌抗原在結(jié)核病檢測方面具有重要意義。本課題主要是對結(jié)核分枝桿菌 RD1區(qū)多種和Rv3452抗原進(jìn)行制備，并研究制備出的結(jié)核分枝桿菌抗原在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

2、價值。
　　方法：根據(jù)文獻(xiàn)報道，從TB databases數(shù)據(jù)庫（http://tb.lanl.gov/content/index）下載結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株RD1區(qū)及Rv3452抗原的核苷酸序列和氨基酸序列。運(yùn)用 Biosun生物軟件分析 RD1區(qū)及 Rv3452抗原表位分布情況，篩選峰值較高表位區(qū)段，而后截取其相應(yīng)氨基酸序列和基因序列設(shè)計引物，采用分子克隆技術(shù)克隆相應(yīng)基因，分別構(gòu)建原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化抗原，建立間接

3、 ELISA方法，檢測患者血清中相應(yīng)IgG抗體的水平。
　　結(jié)果：通過原核表達(dá)載體，共成功獲得了5種 RD1去抗原、全長 Rv3452抗原和Rv3452-2區(qū)段抗原。在初步篩選出特異性和敏感性比較好的抗原的基礎(chǔ)上擴(kuò)大檢測樣本，并把樣本進(jìn)行分組。本實驗所用樣本分為三組，第一組為涂片和培養(yǎng)共同陽性組（83例），第二組為涂片陰性且培養(yǎng)陽性組（48例），第三組為涂片和培養(yǎng)共同陰性組（79例）。通過間接ELISA法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示7個抗原

4、敏感性分別為56.19％、26.67%、65.7%、58.57%、60.48%、70.85%和65.24%。Rv3871、Rv3874、Rv3875、Rv3876、Rv3879、Rv3452和Rv3452-2抗原痰培養(yǎng)陽性組的檢出率分別為54.19%、59.54%、27.48%、54.96%、55.73%、70.8%和58.7%。Rv3871、Rv3874、Rv3875、Rv3876、Rv3879、Rv3452和Rv3452-2抗原對痰

5、涂片檢測為陰性組的檢出率分別為62.21%、73.22%、25.98%、58.26%、66.92%、69.29%和69.29%。Rv3871、Rv3874、Rv3875、Rv3876、Rv3879、Rv3452和Rv3452-2抗原對痰培養(yǎng)陰性組的檢出率為59.49%、78.48%、25.31%、65.82%、68.35%、70.88%和75.94%。Rv3871、Rv3874、Rv3875、Rv3876、Rv3879、Rv3452和R

6、v3452-2抗原血清學(xué)法檢測檢出率分別為56.19%、65.7%、26.67%、58.57%、60.48%、70.85%和65.24%。而對相同的樣本涂片法的檢出率為39.52%，培養(yǎng)法的檢出率為62.38%。結(jié)果比較可得 CFP-10（Rv3874）、Rv3452和Rv3452-2三個抗原的檢出率高于培養(yǎng)法的檢出率，同時這七個抗原除ESAT-6（Rv3875）抗原外其它抗原的檢出率均高于涂片法的檢出率。為了了解臨床治療過程中患者的I

7、gG抗體變化水平并評價這些抗原在抗結(jié)核治療效果評價中的應(yīng)用價值，我們選取了88例治療過程中的活動性肺結(jié)核患者的系列血清，分別為治療0個月、2個月、4個月和6個月的血清樣本。對以上標(biāo)本中IgG抗體水平變化進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示7種抗原在88例結(jié)核病患者血清樣本中的檢出率分別為69.3%、73.8%、51.1%、84.1%、71.5%、68.1%和67.1%。其中 OD值水平下降的患者所占的比率分別為47.5%、44.6%、40%、37.8%、

8、31.7%、48.3%和45.7%。OD值上升的患者所占的比例分別為27.8%、35.7%、40%、31.1%、39.6%、40%和30.5%。OD值不變的患者所占的比例分別為24.6%、20%、20%、31.1%、28.5%、11.6%和23.7%，由此結(jié)果可得治療過程中IgG抗體下降的患者所占的比例較大。
　　結(jié)論：結(jié)核病患者體內(nèi)存在針對 RD1區(qū)和Rv3452不同抗原的特異性抗體，而且不同抗原之間存在互補(bǔ)性。結(jié)核病患者體內(nèi)抗