柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cells，PDLCs）是牙周組織的重要組成部分，可分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞，二者分別形成牙骨質(zhì)和牙槽骨，對(duì)牙周組織的修復(fù)具有十分重要的功能[1]。鞣質(zhì)具有顯著的收斂、抗氧化、解毒、抑菌及保護(hù)黏膜等作用。隨著人們對(duì)鞣質(zhì)結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分的深入研究，鞣質(zhì)在口腔臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也日益廣泛。柿子中含有豐富的鞣質(zhì)類物質(zhì)，本研究使用經(jīng)乙醇超聲提取而出的柿鞣質(zhì)提取液，通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，采用M

2、TT、考馬斯亮藍(lán)染色法、堿性磷酸酶法等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，觀察柿鞣質(zhì)水提取液(persimmon tannin water extract)對(duì)PDLCs的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞總蛋白含量及ALP活性的影響，探討柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)人牙周組織修復(fù)再生功能的作用。
　　目的:
　　牙周病是口腔常見病和多發(fā)病，是一種發(fā)生在牙周支持組織上的、以細(xì)菌為主的感染性疾病，是成年人口腔中病理性失牙最主要的原因。很多學(xué)者對(duì)中藥在牙周病的治療和預(yù)防方面進(jìn)行了大量的研

3、究，使用天然藥物防治口腔疾病越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。牙周組織再生是在細(xì)胞合成和分泌蛋白的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，細(xì)胞內(nèi)蛋白含量水平高低可以反映細(xì)胞功能旺盛與否;ALP活性的高低可反映PDLCs向成骨方向轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)旨在體外原代培養(yǎng)PDLCs的基礎(chǔ)上，觀察不同濃度的柿鞣質(zhì)水提取液在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)PDLCs的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞總蛋白含量及ALP活性的影響，明確其對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖作用，為證實(shí)柿鞣質(zhì)具有促進(jìn)牙周健康提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

4、方法:
　　1、柿果實(shí)鞣質(zhì)的提取:對(duì)全柿果實(shí)進(jìn)行超聲提取，并對(duì)柿鞣質(zhì)粗提取液進(jìn)行脫糖，超濾，得到分子量為10000的柿鞣質(zhì)溶液，利用Folin-Denis法測(cè)定提取液中鞣質(zhì)含量。取全柿鞣質(zhì)水提取液，使用0.22μm濾菌器過濾除菌，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br>　　2、細(xì)胞培養(yǎng):取正畸需要拔除的無(wú)齲、無(wú)牙周病的10～16歲青少年前磨牙，隨即放置于含有雙抗預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基中。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌刀片刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪成1

5、 mm×1 mm×1 mm小塊后，平鋪于25 mL培養(yǎng)瓶中，從對(duì)側(cè)加入含有20％血清、0.1％雙抗的DMEM培養(yǎng)基2mL。在CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5％CO2飽和條件下培養(yǎng)4h后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。有細(xì)胞游出后，每隔3天換液。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底壁后，以0.25％胰蛋白酶消化，傳代。凡免疫組化角蛋白陰性、波形蛋白陽(yáng)性的4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　配制系列濃度的柿鞣質(zhì)水提取液:柿鞣質(zhì)水提取液濃度依次為:0.0133 mg/mL、0.02

6、59 mg/mL、0.0389 mg/mL、0.088 mg/mL、0.147mg/mL、0.440 mg/mL及0 mg/mL（對(duì)照組）。
　　MTT法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量變化:取第5代細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化，以1×105/mL的細(xì)胞濃度接種到96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)24 h后，吸棄原有培養(yǎng)液，用PBS液輕輕洗3次，吸干，每孔加入條件培養(yǎng)液200μL，每個(gè)濃度組6個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入M

7、TT（0.5mg/mL）20μL，37℃、5％ CO2飽和條件下培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μL，振蕩10 min，于酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm處溶液的OD值。
　　考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞總蛋白含量:取第5代細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化，以1×105/mL的細(xì)胞濃度接種到96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)24 h后，吸棄原有培養(yǎng)液，每孔加入條件培養(yǎng)液200μL，每個(gè)濃度組6個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、7

8、2 h后，每孔加入100μL0.1％TritonX-100，室溫下振蕩30 min，觀察已無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)后，吸取20μL，轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板，每孔加入考馬斯亮藍(lán)染液200μL，室溫下振蕩10min，用酶標(biāo)儀在590 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的OD值。
　　堿性磷酸酶法測(cè)細(xì)胞活性:取第5代細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化，以1×105/mL的細(xì)胞濃度接種到96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)24 h后，吸棄原有培養(yǎng)液，每孔加入條件培養(yǎng)液200μ

9、L，每個(gè)濃度組6個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入100μL0.1％ TritonX-100，室溫下振蕩30 min，觀察已無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)后，吸取50μL，轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板，每孔加入ALP底物染液100μL，37℃恒溫水浴10 min，每孔加0.2mol/L NaOH50μL止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在410nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的OD值。
　　結(jié)果:
　　1、在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組

10、比較，不同濃度柿鞣質(zhì)水提取液均能促進(jìn)入PDLCs細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)，且呈濃度依賴性。各種濃度柿鞣質(zhì)水提取液（0.0133 mg/mL、0.0259 mg/mL、0.0389 mg/mL、0.088mg/mL、0.147 mg/mL及0.440 mg/mL），在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)，且呈時(shí)間依賴性。
　　2、在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，不同濃度柿鞣質(zhì)水提取液均能

11、促進(jìn)入PDLCs細(xì)胞總蛋白的合成，且呈濃度依賴性。各種濃度柿鞣質(zhì)水提取液（0.0133 mg/mL、0.0259 mg/mL、0.0389 mg/mL、0.088 mg/mL、0.147 mg/mL及0.440 mg/mL），在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞總蛋白的合成，且呈時(shí)間依賴性。
　　3、在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，不同濃度柿鞣質(zhì)水提取液均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞活

12、性增強(qiáng)，且呈濃度依賴性。各種濃度柿鞣質(zhì)水提取液（0.0133 mg/mL、0.0259 mg/mL、0.0389 mg/mL、0.088mg/mL、0.147 mg/mL及0.440 mg/mL），在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞活性增強(qiáng)，且呈時(shí)間依賴性。
　　結(jié)論:
　　柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞數(shù)量、總蛋白質(zhì)含量及細(xì)胞活性均具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性。柿鞣質(zhì)水提取液能促進(jìn)細(xì)胞數(shù)量增