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文檔簡(jiǎn)介
1、牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells,PDLCs)是牙周組織的重要組成部分,可分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞,二者分別形成牙骨質(zhì)和牙槽骨,對(duì)牙周組織的修復(fù)具有十分重要的功能[1]。鞣質(zhì)具有顯著的收斂、抗氧化、解毒、抑菌及保護(hù)黏膜等作用。隨著人們對(duì)鞣質(zhì)結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分的深入研究,鞣質(zhì)在口腔臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也日益廣泛。柿子中含有豐富的鞣質(zhì)類物質(zhì),本研究使用經(jīng)乙醇超聲提取而出的柿鞣質(zhì)提取液,通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),采用M
2、TT、考馬斯亮藍(lán)染色法、堿性磷酸酶法等實(shí)驗(yàn)技術(shù),觀察柿鞣質(zhì)水提取液(persimmon tannin water extract)對(duì)PDLCs的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞總蛋白含量及ALP活性的影響,探討柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)人牙周組織修復(fù)再生功能的作用。
目的:
牙周病是口腔常見病和多發(fā)病,是一種發(fā)生在牙周支持組織上的、以細(xì)菌為主的感染性疾病,是成年人口腔中病理性失牙最主要的原因。很多學(xué)者對(duì)中藥在牙周病的治療和預(yù)防方面進(jìn)行了大量的研
3、究,使用天然藥物防治口腔疾病越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。牙周組織再生是在細(xì)胞合成和分泌蛋白的基礎(chǔ)上進(jìn)行的,細(xì)胞內(nèi)蛋白含量水平高低可以反映細(xì)胞功能旺盛與否;ALP活性的高低可反映PDLCs向成骨方向轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)旨在體外原代培養(yǎng)PDLCs的基礎(chǔ)上,觀察不同濃度的柿鞣質(zhì)水提取液在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)PDLCs的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞總蛋白含量及ALP活性的影響,明確其對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖作用,為證實(shí)柿鞣質(zhì)具有促進(jìn)牙周健康提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
4、方法:
1、柿果實(shí)鞣質(zhì)的提取:對(duì)全柿果實(shí)進(jìn)行超聲提取,并對(duì)柿鞣質(zhì)粗提取液進(jìn)行脫糖,超濾,得到分子量為10000的柿鞣質(zhì)溶液,利用Folin-Denis法測(cè)定提取液中鞣質(zhì)含量。取全柿鞣質(zhì)水提取液,使用0.22μm濾菌器過濾除菌,4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 2、細(xì)胞培養(yǎng):取正畸需要拔除的無(wú)齲、無(wú)牙周病的10~16歲青少年前磨牙,隨即放置于含有雙抗預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基中。在超凈工作臺(tái)內(nèi),無(wú)菌刀片刮取牙根中1/3的牙周膜組織,剪成1
5、 mm×1 mm×1 mm小塊后,平鋪于25 mL培養(yǎng)瓶中,從對(duì)側(cè)加入含有20%血清、0.1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基2mL。在CO2培養(yǎng)箱中,37℃、5%CO2飽和條件下培養(yǎng)4h后,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,繼續(xù)培養(yǎng)。有細(xì)胞游出后,每隔3天換液。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底壁后,以0.25%胰蛋白酶消化,傳代。凡免疫組化角蛋白陰性、波形蛋白陽(yáng)性的4~6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
配制系列濃度的柿鞣質(zhì)水提取液:柿鞣質(zhì)水提取液濃度依次為:0.0133 mg/mL、0.02
6、59 mg/mL、0.0389 mg/mL、0.088 mg/mL、0.147mg/mL、0.440 mg/mL及0 mg/mL(對(duì)照組)。
MTT法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量變化:取第5代細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以1×105/mL的細(xì)胞濃度接種到96孔板,每孔100μL,培養(yǎng)24 h后,吸棄原有培養(yǎng)液,用PBS液輕輕洗3次,吸干,每孔加入條件培養(yǎng)液200μL,每個(gè)濃度組6個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,每孔加入M
7、TT(0.5mg/mL)20μL,37℃、5% CO2飽和條件下培養(yǎng)4h,吸棄培養(yǎng)液,每孔加入DMSO150μL,振蕩10 min,于酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm處溶液的OD值。
考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞總蛋白含量:取第5代細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以1×105/mL的細(xì)胞濃度接種到96孔板,每孔100μL,培養(yǎng)24 h后,吸棄原有培養(yǎng)液,每孔加入條件培養(yǎng)液200μL,每個(gè)濃度組6個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、7
8、2 h后,每孔加入100μL0.1%TritonX-100,室溫下振蕩30 min,觀察已無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)后,吸取20μL,轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板,每孔加入考馬斯亮藍(lán)染液200μL,室溫下振蕩10min,用酶標(biāo)儀在590 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的OD值。
堿性磷酸酶法測(cè)細(xì)胞活性:取第5代細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以1×105/mL的細(xì)胞濃度接種到96孔板,每孔100μL,培養(yǎng)24 h后,吸棄原有培養(yǎng)液,每孔加入條件培養(yǎng)液200μ
9、L,每個(gè)濃度組6個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,每孔加入100μL0.1% TritonX-100,室溫下振蕩30 min,觀察已無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)后,吸取50μL,轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板,每孔加入ALP底物染液100μL,37℃恒溫水浴10 min,每孔加0.2mol/L NaOH50μL止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在410nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的OD值。
結(jié)果:
1、在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),與對(duì)照組
10、比較,不同濃度柿鞣質(zhì)水提取液均能促進(jìn)入PDLCs細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng),且呈濃度依賴性。各種濃度柿鞣質(zhì)水提取液(0.0133 mg/mL、0.0259 mg/mL、0.0389 mg/mL、0.088mg/mL、0.147 mg/mL及0.440 mg/mL),在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng),且呈時(shí)間依賴性。
2、在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),與對(duì)照組比較,不同濃度柿鞣質(zhì)水提取液均能
11、促進(jìn)入PDLCs細(xì)胞總蛋白的合成,且呈濃度依賴性。各種濃度柿鞣質(zhì)水提取液(0.0133 mg/mL、0.0259 mg/mL、0.0389 mg/mL、0.088 mg/mL、0.147 mg/mL及0.440 mg/mL),在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞總蛋白的合成,且呈時(shí)間依賴性。
3、在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),與對(duì)照組比較,不同濃度柿鞣質(zhì)水提取液均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞活
12、性增強(qiáng),且呈濃度依賴性。各種濃度柿鞣質(zhì)水提取液(0.0133 mg/mL、0.0259 mg/mL、0.0389 mg/mL、0.088mg/mL、0.147 mg/mL及0.440 mg/mL),在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞活性增強(qiáng),且呈時(shí)間依賴性。
結(jié)論:
柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞數(shù)量、總蛋白質(zhì)含量及細(xì)胞活性均具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性。柿鞣質(zhì)水提取液能促進(jìn)細(xì)胞數(shù)量增
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