奎尼酸生物合成的代謝工程研究.pdf

1、奎尼酸是一種具有極高價(jià)值的精細(xì)化工產(chǎn)品和醫(yī)藥中間體，在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、化工等行業(yè)均有較大的用途。本研究是將代謝工程技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)奎尼酸基因工程菌的構(gòu)建。根據(jù)代謝工程原理系統(tǒng)分析了細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，并利用DNA重組技術(shù)合理設(shè)計(jì)細(xì)胞代謝途徑及其遺傳修飾，進(jìn)而完成細(xì)胞特性改造。目的是在大腸桿菌中構(gòu)建奎尼酸生物合成途徑，將碳代謝流最大程度的引向奎尼酸生成的方向。 利用大腸桿菌莽草酸途徑合成新的代謝物奎尼酸，需要提高上游幾種代謝中間產(chǎn)物PE

2、P、E4P、DA/HP、DHQ的含量，與之對(duì)應(yīng)的編碼其合成酶的幾種基因分別是ppsA、tktA、aroG、aroB。另外須在宿主細(xì)胞引入編碼與奎尼酸合成有關(guān)的異源酶基因擴(kuò)展代謝途徑，然后串聯(lián)表達(dá)酶基因，同時(shí)適量增加不同種屬的多個(gè)關(guān)鍵酶的有效含量，改善限速反應(yīng)。利用同源重組進(jìn)行基因整合和基因破壞，改造染色體結(jié)構(gòu)定向改變微生物代謝途徑。本文主要從以下幾個(gè)方面對(duì)奎尼酸基因工程菌進(jìn)行了改造： 1．編碼奎尼酸脫氫酶的qutB基因是來(lái)自于構(gòu)

3、巢曲霉。在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一系列包含qutB基因的表達(dá)重組質(zhì)粒。SD序列與起始密碼子不同距離的pBVqutB1，pBVqutB2；具有qutB雙拷貝三基因串聯(lián)的pBVqutBqutBaroG；具有ppsA、tktA、qutB三基因串聯(lián)的pBvPTB，以及新構(gòu)建的單基因重組質(zhì)粒pETqutB，pBVtacqutB，pTrcqutB。并對(duì)含有qutB基因的一系列重組質(zhì)粒在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)與否的驗(yàn)證。結(jié)果顯示pTrcqutB，pBVta

4、cqutB沒(méi)有特異的蛋白表達(dá)帶，說(shuō)明pTrc99a和pBvtac載體不適合用于qutB基因的表達(dá)。pETqutB經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后有特異的蛋白表達(dá)，并且在2-5小時(shí)內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但是時(shí)間更長(zhǎng)(7h)則因?yàn)榈鞍捉到舛霈F(xiàn)表達(dá)蛋白減少的跡象。pBVqutB1和pBVqutB2同本實(shí)驗(yàn)室保存的pBVqutB沒(méi)有出現(xiàn)明顯的蛋白表達(dá)量上的差異，這說(shuō)明利用pBV220表達(dá)載體表達(dá)qutB基因，起始密碼子與SD序列之間距離的遠(yuǎn)近并不是影響其

5、表達(dá)量的關(guān)鍵。含有兩個(gè)qutB基因和一個(gè)aroG基因的多基因串連質(zhì)粒pBVqutBqutBaroG，經(jīng)過(guò)熱誘導(dǎo)，也出現(xiàn)了非常明顯的表達(dá)條帶。 2．對(duì)含有qutB基因在大腸桿菌中可以表達(dá)幾種重組質(zhì)粒進(jìn)行酶活測(cè)定，與含有pBVqutB的對(duì)照菌相比，含有pBVqutB1，pBVqutB2的菌株的奎尼酸脫氫酶的酶活沒(méi)有明顯變化，三基因串聯(lián)的pBVqutBqutBaroG甚至出現(xiàn)了酶活降低的現(xiàn)象。 3．成功地從粗糙脈孢菌的基因組中

6、克隆了奎尼酸脫氫酶的基因qa-3，并與幾種表達(dá)載體連接得到了pBVqa3、pETqa3、pBVtacqa3、pTrcqa3，但是這些質(zhì)粒重組子在大腸桿菌中均沒(méi)有觀察到該基因的特異表達(dá)條帶。 4．結(jié)合qa-3基因的密碼子的特點(diǎn)和計(jì)算機(jī)模擬的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)aq-3基因的密碼子和mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，優(yōu)化該基因的密碼子結(jié)構(gòu)，降低形成mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能，得到新的基因qa3RG<'m>。構(gòu)建的pBVqa3RG<'m>重組質(zhì)

7、粒在大腸桿菌中成功的表達(dá)了奎尼酸脫氫酶，酶活也比對(duì)照明顯提高。同時(shí)還構(gòu)建了ppsA、tktA、qa3RG<'m>三基因串聯(lián)的重組質(zhì)粒pBVPTA。 5．成功的構(gòu)建了pUC-DK、pUC-DAK、pUC-DBK并制備了線性化片段DK、DAK、DBK，為基因敲除和基因替換做好了準(zhǔn)備。利用Red重組系統(tǒng)成功的地進(jìn)行了基因敲除和基因替換，并穩(wěn)定了敲除和替換菌株的基因型，把這株菌株定名為大腸桿菌31K。 6．成功的構(gòu)建奎尼酸發(fā)酵的

8、工程菌5、AP、B、A、BP、5K、APK、BK、AK、BPK、220K。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室搖瓶初步發(fā)酵，在硅膠板上可以初步確定，菌株AP(31BK/pBVPqlA)產(chǎn)生的奎尼酸量最大，也最穩(wěn)定。 7．將菌株AP擴(kuò)大搖瓶發(fā)酵的規(guī)模，然后經(jīng)過(guò)樹(shù)脂富集，HPLC制備，得到了微量的奎尼酸樣品。經(jīng)過(guò)紅外光譜、核磁共振、電子噴霧質(zhì)譜以及紫外、液質(zhì)聯(lián)用等的鑒定可以確定與奎尼酸標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)差異，由此可以確定我們利用生物合成并且分離鑒定了奎尼酸。