奎尼酸生物合成的代謝工程研究.pdf

1、奎尼酸是一種具有極高價值的精細化工產品和醫(yī)藥中間體，在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、化工等行業(yè)均有較大的用途。本研究是將代謝工程技術應用于產奎尼酸基因工程菌的構建。根據代謝工程原理系統(tǒng)分析了細胞代謝網絡，并利用DNA重組技術合理設計細胞代謝途徑及其遺傳修飾，進而完成細胞特性改造。目的是在大腸桿菌中構建奎尼酸生物合成途徑，將碳代謝流最大程度的引向奎尼酸生成的方向。 利用大腸桿菌莽草酸途徑合成新的代謝物奎尼酸，需要提高上游幾種代謝中間產物PE

2、P、E4P、DA/HP、DHQ的含量，與之對應的編碼其合成酶的幾種基因分別是ppsA、tktA、aroG、aroB。另外須在宿主細胞引入編碼與奎尼酸合成有關的異源酶基因擴展代謝途徑，然后串聯(lián)表達酶基因，同時適量增加不同種屬的多個關鍵酶的有效含量，改善限速反應。利用同源重組進行基因整合和基因破壞，改造染色體結構定向改變微生物代謝途徑。本文主要從以下幾個方面對奎尼酸基因工程菌進行了改造： 1．編碼奎尼酸脫氫酶的qutB基因是來自于構

3、巢曲霉。在現(xiàn)有的基礎上構建了一系列包含qutB基因的表達重組質粒。SD序列與起始密碼子不同距離的pBVqutB1，pBVqutB2；具有qutB雙拷貝三基因串聯(lián)的pBVqutBqutBaroG；具有ppsA、tktA、qutB三基因串聯(lián)的pBvPTB，以及新構建的單基因重組質粒pETqutB，pBVtacqutB，pTrcqutB。并對含有qutB基因的一系列重組質粒在大腸桿菌中進行了表達與否的驗證。結果顯示pTrcqutB，pBVta

4、cqutB沒有特異的蛋白表達帶，說明pTrc99a和pBvtac載體不適合用于qutB基因的表達。pETqutB經過IPTG誘導后有特異的蛋白表達，并且在2-5小時內隨著時間的延長而增加，但是時間更長(7h)則因為蛋白降解而出現(xiàn)表達蛋白減少的跡象。pBVqutB1和pBVqutB2同本實驗室保存的pBVqutB沒有出現(xiàn)明顯的蛋白表達量上的差異，這說明利用pBV220表達載體表達qutB基因，起始密碼子與SD序列之間距離的遠近并不是影響其

5、表達量的關鍵。含有兩個qutB基因和一個aroG基因的多基因串連質粒pBVqutBqutBaroG，經過熱誘導，也出現(xiàn)了非常明顯的表達條帶。 2．對含有qutB基因在大腸桿菌中可以表達幾種重組質粒進行酶活測定，與含有pBVqutB的對照菌相比，含有pBVqutB1，pBVqutB2的菌株的奎尼酸脫氫酶的酶活沒有明顯變化，三基因串聯(lián)的pBVqutBqutBaroG甚至出現(xiàn)了酶活降低的現(xiàn)象。 3．成功地從粗糙脈孢菌的基因組中

6、克隆了奎尼酸脫氫酶的基因qa-3，并與幾種表達載體連接得到了pBVqa3、pETqa3、pBVtacqa3、pTrcqa3，但是這些質粒重組子在大腸桿菌中均沒有觀察到該基因的特異表達條帶。 4．結合qa-3基因的密碼子的特點和計算機模擬的mRNA二級結構，對aq-3基因的密碼子和mRNA二級結構進行改造，優(yōu)化該基因的密碼子結構，降低形成mRNA二級結構的自由能，得到新的基因qa3RG<'m>。構建的pBVqa3RG<'m>重組質

7、粒在大腸桿菌中成功的表達了奎尼酸脫氫酶，酶活也比對照明顯提高。同時還構建了ppsA、tktA、qa3RG<'m>三基因串聯(lián)的重組質粒pBVPTA。 5．成功的構建了pUC-DK、pUC-DAK、pUC-DBK并制備了線性化片段DK、DAK、DBK，為基因敲除和基因替換做好了準備。利用Red重組系統(tǒng)成功的地進行了基因敲除和基因替換，并穩(wěn)定了敲除和替換菌株的基因型，把這株菌株定名為大腸桿菌31K。 6．成功的構建奎尼酸發(fā)酵的

8、工程菌5、AP、B、A、BP、5K、APK、BK、AK、BPK、220K。通過實驗室搖瓶初步發(fā)酵，在硅膠板上可以初步確定，菌株AP(31BK/pBVPqlA)產生的奎尼酸量最大，也最穩(wěn)定。 7．將菌株AP擴大搖瓶發(fā)酵的規(guī)模，然后經過樹脂富集，HPLC制備，得到了微量的奎尼酸樣品。經過紅外光譜、核磁共振、電子噴霧質譜以及紫外、液質聯(lián)用等的鑒定可以確定與奎尼酸標準品無差異，由此可以確定我們利用生物合成并且分離鑒定了奎尼酸。