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1、S-腺苷蛋氨酸(SAM)廣泛存在于生物體細(xì)胞中,參與體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫基和聚胺合成等多種重要的反應(yīng),它在肝病、抑郁癥和關(guān)節(jié)炎等疾病的治療與預(yù)防中有重要的應(yīng)用,市場(chǎng)需求量巨大。本文運(yùn)用代謝工程技術(shù)對(duì)釀酒酵母工業(yè)菌株ZJU001中SAM合成的相關(guān)代謝途徑進(jìn)行改造以提高SAM的產(chǎn)量。
在菌株ZJU001中利用多拷貝整合型質(zhì)粒pYMIKP-SAM2實(shí)現(xiàn)了SAM2基因的過(guò)表達(dá),增加了胞內(nèi)SAM合成酶的表達(dá)量,提高菌株合成SAM的能力。在1
2、0L發(fā)酵罐上,改造菌株的SAM產(chǎn)量達(dá)到8.81g/L,比原始菌株提高了27.1%。
以模式菌株BY4741為對(duì)象開(kāi)展了釀酒酵母胞內(nèi)合成SAM相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)的研究。從SAM合成的底物供給、SAM合成后的累積及降解途徑等角度出發(fā),分別構(gòu)建了P型ATP酶基因PMR1、糖原支鏈酶基因GLC3、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶基因PHO85和SAM脫羧酶基因SPE2等四個(gè)基因敲除的突變菌株。考察各突變菌株SAM的合成能力,發(fā)現(xiàn)GLC3和SPE2的單
3、獨(dú)缺失有利于釀酒酵母對(duì)SAM的合成與積累。
為提高工業(yè)菌株ZJU001中基因敲除的穩(wěn)定性,建立了一套針對(duì)雙倍體工業(yè)菌株的基因快速敲除的新方法。構(gòu)建了ZJU001中的GLC3、SPE2、ERG4和ERG6四個(gè)基因分別敲除及GAL11基因過(guò)表達(dá)的五個(gè)突變菌株。通過(guò)考察突變菌株的SAM合成能力,結(jié)果顯示GLC3和SPE2基因敲除的突變菌株其SAM產(chǎn)量分別提高了20.1%和12.4%。
運(yùn)用標(biāo)記回收的基因敲除技術(shù)在ZJU00
4、1中同時(shí)敲除GLC3和SPE2,并過(guò)表達(dá)SAM2,獲得工程菌ZJU001-GS-SAM2。該菌在搖瓶發(fā)酵中的SAM產(chǎn)量達(dá)到1.14g/L,是出發(fā)菌株的1.7倍,結(jié)果表明三個(gè)基因改造對(duì)促進(jìn)SAM的合成和積累具有協(xié)同作用。
運(yùn)用反饋控制分批補(bǔ)料發(fā)酵策略在10L罐上考察了ZJU001-glc3、ZJU001-spe2、ZJU001-GS以及ZJU001-GS-SAM2的SAM生產(chǎn)能力,結(jié)果顯示ZJU001-GS-SAM2的SAM產(chǎn)量
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