代謝工程概述

1、代謝工程( Metabolic Engineering ),2,第一節(jié) 代謝工程概述,現(xiàn)代生物技術(shù)手段主要包括：基因工程 (Gene Engineering)細(xì)胞工程 (Cell Engineering)發(fā)酵工程 (Fermentation Engineering)酶工程 (Enzyme Engineering),現(xiàn)代生物技術(shù)在化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)林牧漁、輕工食品、能源和環(huán)境等領(lǐng)域都將發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的改造和新

2、型產(chǎn)業(yè)的形成，對(duì)人類(lèi)社會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。其中發(fā)酵工程是生物技術(shù)的重要組成部分，是生物技術(shù)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品的重要環(huán)節(jié)。20世紀(jì)90年代提出的代謝工程發(fā)展迅速，被視為繼傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)多肽單基因表達(dá)（第一代基因工程）、基因定向突變（第二代基因工程）之后的第三代基因工程。,代謝工程的產(chǎn)生,微生物發(fā)酵已經(jīng)有幾千年的歷史，早在2000多年以前，人們就開(kāi)始利用微生物進(jìn)行白酒、黃酒、葡萄酒、啤酒和清酒等的發(fā)酵，此時(shí)的發(fā)酵被稱(chēng)為天然發(fā)酵時(shí)代。20世紀(jì)40年

3、代，隨著抗生素青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)的大規(guī)模進(jìn)行，開(kāi)始了現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)時(shí)代。通過(guò)自然選擇的方法，人們用10-6的突變幾率來(lái)篩選所謂的高產(chǎn)菌株。由于沒(méi)有代謝控制發(fā)酵理論作為指導(dǎo)，直到20世紀(jì)60年代現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)仍處于盲目階段。,1956年，日本木下祝朗博士等從東京上野動(dòng)物園鳥(niǎo)糞中分離篩選到谷氨酸產(chǎn)生菌，1957年日本協(xié)和發(fā)酵公司成功地進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，這是整個(gè)氨基酸發(fā)酵的開(kāi)始，繼而迅速掀起了一股氨基酸發(fā)酵研究的熱潮。隨著對(duì)代謝發(fā)酵理論的深入研究，轉(zhuǎn)

4、向發(fā)酵菌株本身的研究，獲得了很多的氨基酸高產(chǎn)菌株。隨后，核酸類(lèi)物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生菌也以代謝控制發(fā)酵理論為指導(dǎo)進(jìn)行選育，并奮起直追成為后起之秀。,5,家有味之素,白水變雞汁,日本東京帝國(guó)大學(xué)的教授池田菊苗，1909年,中國(guó)，味精，吳蘊(yùn)初，1923年,,氨基酸和核苷酸發(fā)酵的研究進(jìn)一步推動(dòng)了抗生素發(fā)酵的研究與生產(chǎn)，發(fā)酵由野生型發(fā)酵向高度人為控制的發(fā)酵轉(zhuǎn)移；由依賴(lài)于微生物分解代謝的發(fā)酵轉(zhuǎn)向依賴(lài)于生物合成的發(fā)酵，即向代謝產(chǎn)物大量積累的方向轉(zhuǎn)移。,,

5、代謝控制發(fā)酵就是利用遺傳學(xué)的方法或生物化學(xué)方法，人為地在DNA分子水平上改變和控制微生物的代謝，使得目的產(chǎn)物大量的生成、積累的發(fā)酵。代謝控制發(fā)酵的核心：解除微生物代謝控制機(jī)制，打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，人為地控制微生物的代謝。,,隨著代謝控制發(fā)酵理論的逐漸完善，目前已發(fā)展出一個(gè)重要的研究分支——代謝工程。它是近年來(lái)分子生物學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)工程學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展與交叉的產(chǎn)物，從而使生物技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，使有關(guān)的研究進(jìn)入了細(xì)胞

6、水平。從細(xì)胞的代謝途徑出發(fā)，運(yùn)用工程學(xué)原理進(jìn)行代謝調(diào)控，使之向產(chǎn)物積累的方向發(fā)展，由此創(chuàng)建了一個(gè)新興的領(lǐng)域，即“代謝工程”。,代謝工程的理論首先由Jay Bailey于1991年在“Science”雜志上論述了代謝工程的應(yīng)用、潛力和設(shè)計(jì)。同年，Greg Stephanopoulos和Joseph Vallino在“Science”雜志上論述了有關(guān)“過(guò)量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物時(shí)的代謝工程”、“代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性、代謝流的分配、關(guān)鍵分叉點(diǎn)及速度限制步

7、驟”等內(nèi)容。 代謝工程也被稱(chēng)為“途徑工程”，是基因工程的重要分支。,隨著DNA重組技術(shù)的日趨成熟，代謝工程的理論和應(yīng)用得到了發(fā)展。代謝工程定義的演變過(guò)程如下：（1）1988年MacQuitty指出，微生物途徑工程(Microbial Pathway engineering)是利用DNA重組技術(shù)修飾各種代謝途徑（包括生物體非固有的代謝途徑），提高特定代謝物的產(chǎn)量。（2）1991年Bailey將代謝工程(Metabolic eng

8、ineering)定義為：利用DNA重組技術(shù)優(yōu)化細(xì)胞的酶活、轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控功能，提高細(xì)胞活力。,（3）1991年Tong等將代謝途徑工程(Metabolic pathway engineering)定義：生化途徑的修飾、設(shè)計(jì)與構(gòu)建。 （4）1993年Cameron認(rèn)為，代謝工程(Metabolic Engineering)是利用DNA重組技術(shù)對(duì)代謝進(jìn)行目的性修飾。（5）1994年P(guān)ieperberg認(rèn)為代謝工程/途徑工程(Pathway

9、 engineering/Metabolic design)是改造細(xì)胞代謝途徑，提高天然最終產(chǎn)物產(chǎn)量或合成新產(chǎn)物包括中間產(chǎn)物或修飾型最終產(chǎn)物。,（6）1994年Gregory將代謝工程(Metabolic Engineering)定義：代謝工程是對(duì)生化反應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行目的性修飾。（7）1996年William將代謝工程(Metabolic Engineering)定義：為達(dá)到所需目的，對(duì)活細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行修飾。（8）1999年K

10、offasl將代謝工程(Metabolic Engineering)定義：利用分子生物學(xué)原理系統(tǒng)分析代謝途徑，設(shè)計(jì)合理的遺傳修飾戰(zhàn)略從而優(yōu)化細(xì)胞生物學(xué)特性。,代謝工程較系統(tǒng)的定義 應(yīng)用重組DNA技術(shù)和應(yīng)用分析生物學(xué)相關(guān)的遺傳學(xué)手段進(jìn)行有精確目標(biāo)的遺傳操作，改變酶的功能或輸送體系的功能，甚至產(chǎn)能系統(tǒng)的功能，以改進(jìn)細(xì)胞某些方面的代謝活性的整套操作工作（包括代謝分析、代謝設(shè)計(jì)、遺傳操作、目的代謝活性的實(shí)現(xiàn)）。 簡(jiǎn)而言之，

11、代謝工程是生物化學(xué)反應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)有目的的修飾。 代謝工程要解決的主要問(wèn)題就是改變某些途徑中的碳架物質(zhì)流量或改變碳架物質(zhì)流在不同途徑中的流量分布。其目標(biāo)就是修飾初級(jí)代謝，將碳架物質(zhì)流導(dǎo)入目的產(chǎn)物的載流途徑以獲得產(chǎn)物的最大轉(zhuǎn)化率。,,代謝工程的主要特征就是利用DNA重組技術(shù)，重建代謝網(wǎng)絡(luò)，改變代謝流及分支代謝速度，以改進(jìn)代謝產(chǎn)物及蛋白類(lèi)產(chǎn)品，由于外源DNA的引入擴(kuò)展了固有的代謝途徑，獲得了新的化學(xué)物質(zhì)。改變轉(zhuǎn)化蛋白的過(guò)程，減少

12、不必要的廢物。例如，谷氨酸發(fā)酵,代謝工程的研究?jī)?nèi)容,1、代謝流的定量和定向 （1）流量評(píng)計(jì)原理 A 基于模型動(dòng)力學(xué) B 控制理論 C 示蹤實(shí)驗(yàn)（2）代謝流的定向 A 利用環(huán)境控制 B 改變細(xì)胞組成的控制 C 代謝流向的目標(biāo)產(chǎn)物的增加,2 、細(xì)胞對(duì)底物的吸收和產(chǎn)品的釋放模型及分析 （1）轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)

13、程的生物化學(xué) A 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白機(jī)制：載體通道泵 B 轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué) C 載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)的能量方面：偶聯(lián)的概念 D 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性的調(diào)節(jié)（2）研究方法方面 A 轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的實(shí)驗(yàn)分析 B 擴(kuò)散和載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)間的區(qū)別 C 轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程動(dòng)力學(xué)分析 D 生物過(guò)程中的轉(zhuǎn)運(yùn)分析,3、研究胞內(nèi)代謝物濃度的反應(yīng)工程方法 （1）用于胞內(nèi)核磁共振研

14、究的反應(yīng)工程 （2）胞內(nèi)代謝物分析快速反應(yīng)取樣的反應(yīng)工程4、 用13C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)進(jìn)行胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)流分析 （1）穩(wěn)態(tài)流分析 （2）測(cè)定穩(wěn)態(tài)胞內(nèi)數(shù)據(jù) （3）代謝物13C標(biāo)記系統(tǒng)的模型 （4）模擬和數(shù)據(jù)分析 （5）穩(wěn)態(tài)標(biāo)記系統(tǒng)的綜合分析,代謝工程的研究手段,1、采用遺傳學(xué)手段的遺傳操作 （1）基因工程技術(shù)的應(yīng)用 （2）常規(guī)誘變技術(shù)的應(yīng)用 2、 生物合成途徑的代謝調(diào)控

15、 （1）生物合成中間產(chǎn)物的定量生物測(cè)定 （2）共合成法在生物合成中的應(yīng)用 （3）酶的誘導(dǎo)合成和分解代謝產(chǎn)物阻遏,,3、研究生物合成機(jī)制的常用方法 （1）刺激實(shí)驗(yàn)法 （2）同位素示蹤法 （3）洗滌菌絲懸浮法 （4）無(wú)細(xì)胞抽提法 （5）遺傳特性誘變法,,刺激實(shí)驗(yàn)法：在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入某些可能是前體的物質(zhì)，觀(guān)察該物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中的被利用情況與促進(jìn)目的

16、產(chǎn)物生成的效果。洗滌菌絲法（或稱(chēng)靜息細(xì)胞法）：取不同生長(zhǎng)階段的菌絲，先洗去沾染的原培養(yǎng)基成分及代謝產(chǎn)物，然后將菌絲懸浮于人工培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，在一定條件下繼續(xù)觀(guān)察被試驗(yàn)的化合物對(duì)菌體代謝和對(duì)產(chǎn)物合成的影響。,,無(wú)細(xì)胞抽提法：用適當(dāng)?shù)姆椒◤募?xì)胞中分離純化制得純酶。將制得的純酶和有關(guān)物質(zhì)加入到反應(yīng)體系、進(jìn)行酶促反應(yīng)，檢測(cè)反應(yīng)體系中的底物和產(chǎn)物濃度，判斷該酶是否催化目的產(chǎn)物的生物合成。,具體來(lái)講，代謝工程的研究方法如下：1、分子生物學(xué)方法：構(gòu)

17、建特殊的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，尤其對(duì)于具有較高生產(chǎn)價(jià)值的微生物，具有重要意義。例如Backman等利用切割載體獲得酪氨酸(Tyr)營(yíng)養(yǎng)缺陷型，為構(gòu)建苯丙氨酸的生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。,,2、分析化學(xué)及檢測(cè)方法：代謝工程的研究對(duì)象是代謝途徑，因此必須對(duì)代謝通路中的一些酶及產(chǎn)物進(jìn)行研究和分析。傳統(tǒng)的分析通路阻斷的手段有：物質(zhì)平衡、同位素標(biāo)記、分析障礙突變體等，目前它們?nèi)匀皇潜夭豢缮俚氖侄危舜殴舱?、流式?xì)胞術(shù)的應(yīng)用則為這一領(lǐng)域的發(fā)展增添了新的活力。,,

18、3、數(shù)學(xué)及計(jì)算機(jī)工具：研究代謝工程不僅需要遺傳學(xué)知識(shí)，而且需要對(duì)寄主菌的生化代謝途徑和生理學(xué)有深入的理解，所以將DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的信息應(yīng)用于代謝工程并開(kāi)發(fā)出適合的軟件系統(tǒng)是十分必要的，Karp等構(gòu)建了981個(gè)生命體化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，為未來(lái)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。人們已在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合數(shù)學(xué)和化學(xué)的理論，發(fā)展了一些人工智能程序。,KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),http://www.genome.jp/kegg/,代謝工程的三個(gè)基本觀(guān)點(diǎn),在生物工程受到廣泛重視的今天，

19、有必要把微生物(菌種選育)、微生物學(xué)過(guò)程(發(fā)酵工藝)和微生物學(xué)體系(生物反應(yīng)器)作為一個(gè)整體，在科學(xué)的水平上對(duì)工業(yè)發(fā)酵進(jìn)行重新審視。從工業(yè)發(fā)酵的現(xiàn)狀出發(fā)，主要根據(jù)對(duì)碳元素代謝及其控制，菌種是化能異養(yǎng)型微生物，產(chǎn)物是微生物細(xì)胞排出細(xì)胞的代謝中間產(chǎn)物的工業(yè)發(fā)酵，提出了3個(gè)基本觀(guān)點(diǎn)。,1.生物能支撐觀(guān)點(diǎn)微生物細(xì)胞是工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)者，微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)和維持需要由其自身的能量轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)或從其他形式的能量轉(zhuǎn)化形成的生物能來(lái)支撐。因此，工業(yè)

20、發(fā)酵具有生物學(xué)屬性。2.代謝網(wǎng)絡(luò)觀(guān)點(diǎn)由生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和跨輸送步驟組成的代謝網(wǎng)絡(luò)既沒(méi)有絕對(duì)的起點(diǎn)，也沒(méi)有絕對(duì)的終點(diǎn)。代謝網(wǎng)絡(luò)中任何一種中間產(chǎn)物(或可借助生物學(xué)、化學(xué)方法與代謝網(wǎng)絡(luò)聯(lián)網(wǎng)的任何一種化合物)都可能被開(kāi)發(fā)成為工業(yè)發(fā)酵的目的產(chǎn)物或原料。,,3.細(xì)胞經(jīng)濟(jì)觀(guān)點(diǎn)微生物細(xì)胞的經(jīng)濟(jì)性是在自然選擇的過(guò)程中逐漸形成的。野生的(未經(jīng)人工變異的)微生物細(xì)胞在自然選擇的過(guò)程中逐漸形成競(jìng)爭(zhēng)型的細(xì)胞經(jīng)濟(jì)。而工業(yè)發(fā)酵往往要以目的產(chǎn)物的生產(chǎn)為主導(dǎo)，

21、調(diào)整代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝流，構(gòu)建一種導(dǎo)向型細(xì)胞經(jīng)濟(jì)。從競(jìng)爭(zhēng)型細(xì)胞經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)變?nèi)Q于遺傳和環(huán)境因素的信息導(dǎo)向，這種導(dǎo)向必須遵循細(xì)胞經(jīng)濟(jì)的基本運(yùn)行規(guī)律。,第二節(jié) 代謝工程的基本理論,一、基本概念二、代謝物流及其相關(guān)特性三、代謝網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)分析,,,,向心途徑,中心代謝途徑,離心途徑,碳架物質(zhì)從向心板塊注入中心板塊時(shí)所流經(jīng)的代謝途徑統(tǒng)稱(chēng)向心途徑。在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)器中的微生物細(xì)胞的代謝是分步進(jìn)行的。胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(一般要經(jīng)胞外酶降解后)從培養(yǎng)

22、介質(zhì)跨膜進(jìn)入細(xì)胞，(一般要)經(jīng)過(guò)“向心途徑”、“中心途徑”和“離心途徑”等連續(xù)的代謝途徑的代謝，才能在胞內(nèi)生成目的產(chǎn)物，最后，目的產(chǎn)物跨過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜排出細(xì)胞回到培養(yǎng)介質(zhì)中。,1、胞外酶對(duì)原料的降解及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程2、經(jīng)胞內(nèi)降解代謝途徑匯入中心代謝途徑3、中心代謝途徑及其控制4、合成代謝流及其控制5、目的產(chǎn)物的跨膜及其控制,,典型的理想載流途徑應(yīng)該由以上五段承擔(dān)不同代謝分工的依次銜接的代謝途徑組成。這就是載流途徑的“五段式”

23、。在這條載流途徑上流動(dòng)的代謝主流對(duì)應(yīng)地也有五段，這就是代謝主流的“五段式”。,一、基本概念,1）底物 培養(yǎng)基中存在的化合物，是能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝或直接構(gòu)成細(xì)胞組分。碳源、氮源、能源以及能滿(mǎn)足細(xì)胞功能必須的各種礦物元素均屬于細(xì)胞代謝的底物。葡萄糖作為細(xì)胞生長(zhǎng)的主要碳源，是最常見(jiàn)的底物。 2）代謝產(chǎn)物 由細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中的化合物，可以是初級(jí)代謝產(chǎn)物（如二氧化碳、乙醇等），也可以是次級(jí)代謝產(chǎn)物或蛋白質(zhì)。

24、 3）生物基質(zhì)要素 構(gòu)成生物基質(zhì)大分子池的一類(lèi)物質(zhì)，包括RNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物等。,4）胞內(nèi)代謝物 是細(xì)胞內(nèi)其他化合物，包括不同代謝途徑的中間代謝物和用于大分子合成的結(jié)構(gòu)單元等。 5）途徑 是指催化總的代謝物的轉(zhuǎn)化、信息傳遞和其他細(xì)胞功能的酶促反應(yīng)的集合 6）生化反應(yīng)途徑和代謝途徑 一系列按序進(jìn)行的生物化學(xué)反應(yīng)途徑。若這條途徑在活細(xì)胞里運(yùn)行，則為代謝途徑。,7）生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)

25、生化反應(yīng)途徑按生物化學(xué)規(guī)律匯成生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。 8）代謝網(wǎng)絡(luò) 分解代謝途徑、合成代謝途徑和膜輸送體系的有序組合構(gòu)成代謝網(wǎng)絡(luò)。廣義的代謝網(wǎng)絡(luò)包括物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)和能量代謝網(wǎng)絡(luò)。代謝網(wǎng)絡(luò)的組成取決于微生物的遺傳特性和微生物細(xì)胞存在的環(huán)境。,葡萄糖琥珀酸 草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸 乳酸

26、 丙酮酸 乙醛 乙酰 CoA 甲酸 乙醇 乙酰磷酸 CO2 H2

27、 乙酸,,,,,,,,,,,,,,,,丙酮酸甲酸裂解酶,乳酸脫氫酶,甲酸-氫裂解酶,磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶,乙酸激酶,PEP羧化酶,乙醛脫氫酶,+2H,pH﹤6.2,乙醇脫氫酶,9）代謝網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)網(wǎng) 代謝中間化合物都在代謝網(wǎng)絡(luò)上，有些有機(jī)化合物雖然不在網(wǎng)絡(luò)上但仍有可能與代謝網(wǎng)絡(luò)聯(lián)網(wǎng)。所謂“聯(lián)網(wǎng)”，就是用化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)把指定的化合物連接到代謝網(wǎng)絡(luò)上去，從而使它與微生物的代謝建立聯(lián)系。 聯(lián)網(wǎng)可以用化學(xué)或生物學(xué)方法（

28、含重組DNA技術(shù)）實(shí)現(xiàn)。廣義的聯(lián)網(wǎng)包含生命有機(jī)體之間接力賽式的代謝聯(lián)系。已在網(wǎng)絡(luò)上或者可以聯(lián)網(wǎng)的化合物都可能開(kāi)發(fā)成為發(fā)酵工業(yè)的產(chǎn)物或原料。,①必須遵循細(xì)胞物質(zhì)代謝規(guī)律及途徑組合的生物化學(xué)原理，它提供了生物體的基本代謝圖譜及其生化反應(yīng)的分子機(jī)理。 ②必須遵循細(xì)胞代謝流及控制分析的化學(xué)計(jì)量學(xué)、分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)以及控制學(xué)原理。這是代謝途徑改造的理論依據(jù)。 ③必須遵循途徑代謝流推動(dòng)力的酶學(xué)原理，包括酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、

29、變構(gòu)抑制效應(yīng)、修飾激活效應(yīng)等。,代謝工程應(yīng)遵循的基本原理,代謝工程是多學(xué)科高度交叉的新興領(lǐng)域，主要目標(biāo)是通過(guò)定向重組代謝網(wǎng)絡(luò)，從而達(dá)到改良生物體遺傳性狀的目的。為此，它必須遵循下列基本原理：,④必須遵循基因操作與控制的分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)原理，它們需要已闡明的基因表達(dá)的基本規(guī)律，同時(shí)也提供了基因操作的一整套相關(guān)技術(shù)。⑤必須遵循細(xì)胞生理狀態(tài)平衡的細(xì)胞生理學(xué)原理，它為細(xì)胞代謝機(jī)制提供了一個(gè)全景式的描述，因此是一個(gè)代謝速率和生理狀態(tài)表征

30、研究的平臺(tái)。,⑥必須遵循發(fā)酵或細(xì)胞培養(yǎng)的工藝學(xué)和工程控制的生化工程和化學(xué)工程原理。 化學(xué)工程無(wú)疑是將工程方法運(yùn)用與生物系統(tǒng)研究的最合適的渠道。從一般意義上來(lái)說(shuō)，這種方法在生物系統(tǒng)的研究中融入了綜合、定量、相關(guān)等概念。更為重要的是，它為速率受限制的系統(tǒng)分析提供了獨(dú)特的工具和經(jīng)驗(yàn)，因此在代謝工程領(lǐng)域中具有舉足輕重的意義。,⑦必須遵循有關(guān)生物信息收集分析與應(yīng)用的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)原理。 隨著基因組計(jì)劃的深入發(fā)展，各生物物種的

31、基因物理信息與其生物功能信息在此交匯，并為代謝網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)提供了更為廣闊的展示平臺(tái)。這是代謝工程技術(shù)迅猛發(fā)展和廣泛應(yīng)用的最大推動(dòng)力。,1、基本概念 1）代謝流和碳架物質(zhì)流 代謝物在代謝途徑中流動(dòng)形成代謝流。具體地說(shuō)，處于一定環(huán)境條件下的微生物培養(yǎng)物中，參與代謝的物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡(luò)中按一定規(guī)律流動(dòng)，形成微生物的代謝流。代謝流具備流體流動(dòng)的一些基本屬性，如方向性、連續(xù)性、有序性、可調(diào)性等，也可以接受疏導(dǎo)、阻塞、分流、匯流等“治理”，也可

32、能發(fā)生“干枯”或“溢出”等現(xiàn)象。在代謝工程領(lǐng)域，代謝流往往是指碳架物質(zhì)流。,二、代謝物流及其相關(guān)特性,2）代謝主流 在一定的培養(yǎng)條件下，代謝物在代謝網(wǎng)絡(luò)中流動(dòng)，流量相對(duì)集中的代謝流叫做該條件下的代謝主流。 代謝途徑（網(wǎng)絡(luò)）的延伸和剪接都可能改變代謝主流，從而實(shí)現(xiàn)新基質(zhì)的利用和新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。代謝主流的流量測(cè)定是代謝工程的重要組成部分。,3）載流途徑 代謝主流流經(jīng)的代謝途徑為主要載流途徑，簡(jiǎn)稱(chēng)載流途徑。在代謝工程領(lǐng)域，是指

33、碳流在代謝網(wǎng)絡(luò)中通過(guò)的主要途徑，即生產(chǎn)所需產(chǎn)物期間讓碳流相對(duì)集中流向產(chǎn)物合成的途徑。,碳架代謝的三個(gè)子系統(tǒng)微生物碳架物質(zhì)的初級(jí)代謝大致可分成三個(gè)子系統(tǒng)，一個(gè)分解代謝子系統(tǒng)（子系統(tǒng)Ⅰ）和兩個(gè)合成代謝子系統(tǒng)（子系統(tǒng)Ⅱ分子模塊的合成代謝子系統(tǒng)和子系統(tǒng)Ⅲ生物大分子的代謝合成子系統(tǒng)）。,ATP代表代謝能，分子模塊代表氨基酸、核苷酸等參與生物大分子組成的單元化合物，碳架代表PYR，R-5-P，α-KG 等前體代謝物。虛箭頭和實(shí)箭頭分別代表代謝系統(tǒng)

34、內(nèi)部的松散的和緊密的聯(lián)系。,子系統(tǒng) Ⅰ（碳源的分解代謝子系統(tǒng)）微生物細(xì)胞用以合成前體代謝物和提供代謝能的碳源分解代謝系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)最容易直接受外界環(huán)境條件在生理許可范圍內(nèi)的影響?？赡苁且?yàn)樘荚吹姆纸獯x有多條途徑可供選擇；此外，可能是因?yàn)榉纸獯x的酶主要分布在細(xì)胞內(nèi)可溶部分和膜上，易受外界條件影響。,② 子系統(tǒng) Ⅱ（ 合成分子模塊的子系統(tǒng)） 微生物細(xì)胞用以合成生物大分子的標(biāo)準(zhǔn)單元的合成代謝系統(tǒng)。所謂分子模塊一般是指用于多糖合成的

35、G-1-P， 用于蛋白質(zhì)合成的各種氨基酸，用于RNA 和 DNA 合成的各種核苷酸和脫氧核苷酸，以及用于類(lèi)異戊二烯化合物合成的異戊烯基焦磷酸等。,③子系統(tǒng)Ⅲ：生物大分子合成代謝子系統(tǒng) 用以生成蛋白質(zhì)、DNA 、RNA 、各種多糖 ( 同多糖、雜多糖、肽多糖、脂多糖、莢膜多糖等) 及類(lèi)脂（ 含類(lèi)異戊二烯化合物）等細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生物大分子合成代謝系統(tǒng)。,只有當(dāng)以上三個(gè)代謝子系統(tǒng)作為一個(gè)整體來(lái)運(yùn)行，微生物細(xì)胞才能維持生命循環(huán)。只有當(dāng)生命循

36、環(huán)得到維持，我們才有可能通過(guò)微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)，生產(chǎn)微生物產(chǎn)品。,三子系統(tǒng)之間的關(guān)系： 子系統(tǒng)Ⅰ生成 ATP, 子系統(tǒng) Ⅱ和Ⅲ使用ATP。但是子系統(tǒng)Ⅰ中ATP如何合成并不嚴(yán)重影響子系統(tǒng)Ⅱ和子系統(tǒng) Ⅲ 對(duì)ATP 的使用。 因此可以認(rèn)為子系統(tǒng) Ⅰ與整個(gè)合成系統(tǒng) （ Ⅱ + Ⅲ ） 之間的聯(lián)系是較為松散的。子系統(tǒng)Ⅰ 生成的前體代謝物的質(zhì)和量強(qiáng)烈地影響子系統(tǒng)Ⅱ的運(yùn)行，因此子系統(tǒng)Ⅰ與 Ⅱ之間的聯(lián)系是緊密的 。子系統(tǒng) Ⅰ 與 Ⅲ 之間幾

37、乎僅僅通過(guò) ATP 相聯(lián)系， 因此Ⅰ 與 Ⅲ之間的聯(lián)系是松散的。 分子模塊 ( 如氨基酸 ) 在細(xì)胞內(nèi)通?？梢杂坞x狀態(tài)存在，由此推測(cè)，子系統(tǒng)Ⅱ與 Ⅲ 也只是松散的關(guān)系。,子系統(tǒng)Ⅰ和子系統(tǒng)Ⅱ 分別與子系統(tǒng) Ⅲ 只發(fā)生松散的聯(lián)系，這就是子系統(tǒng)Ⅰ具有相對(duì)獨(dú)立的運(yùn)轉(zhuǎn)（ 排出能量代謝副產(chǎn)物）能力的原因之一，也是 “ 子系統(tǒng)Ⅰ+ 子系統(tǒng)Ⅱ” 作為一個(gè)整體具有相對(duì)獨(dú)立的運(yùn)轉(zhuǎn)（排出分子模塊）能力的原因之一。,相對(duì)獨(dú)立運(yùn)行的另一個(gè)重要原因是細(xì)胞

38、的分泌機(jī)制。子系統(tǒng)Ⅰ相對(duì)獨(dú)立運(yùn)轉(zhuǎn)的過(guò)程中，細(xì)胞可能分泌乙醇等能量代謝的副產(chǎn)物； “ 子系統(tǒng)Ⅰ+ 子系統(tǒng)Ⅱ ” 相對(duì)獨(dú)立運(yùn)轉(zhuǎn)的過(guò)程中，細(xì)胞可能分泌氨基酸等分子模塊；三個(gè)子系統(tǒng)協(xié)調(diào)運(yùn)轉(zhuǎn)，微生物細(xì)胞生長(zhǎng)迅速。還有可能分泌酶、多糖、多肽等生物大分子，同時(shí)放慢生長(zhǎng)速度。,4）代謝主流的變動(dòng)性和選擇性 微生物的代謝主流處于不斷變化之中，其方向、流量甚至代謝主流的載流途徑都可能發(fā)生變化。這就是微生物代謝主流的變動(dòng)性和代謝主流對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)途徑的

39、選擇性。這種變動(dòng)和選擇的根據(jù)在于微生物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，選擇的原因是微生物所處的環(huán)境條件的變化。,5）理想載流途徑 為了提高產(chǎn)物對(duì)原料的轉(zhuǎn)化率，要求代謝主流（根據(jù)代謝分析的結(jié)果）從設(shè)定的途徑流過(guò)，是它成為載流途徑。因?yàn)檫@樣的載流途徑是帶有主觀(guān)導(dǎo)向性的虛擬的載流途徑，所以把它稱(chēng)為理想載流途徑。,1）代謝物流與酶的關(guān)系 在代謝工程中，把酶促反應(yīng)看作代謝系統(tǒng)的基本組成部分，而把基因、酶的水平、代謝物濃度、抑制機(jī)制、效應(yīng)物、抑制

40、劑與激活劑、環(huán)境條件等的影響歸結(jié)為對(duì)酶促反應(yīng)的擾動(dòng)。,2、代謝物流的相關(guān)特性,2）物流限制 人們一直認(rèn)為代謝途徑存在著固有的限速步驟，它們控制著流經(jīng)代謝途徑的代謝物流，其主要特征表現(xiàn)在： 限速步驟的反應(yīng)速度很低，整個(gè)系統(tǒng)的代謝物流取決于催化該反應(yīng)步驟的酶活性； 限速步驟是熱力學(xué)不可行的反應(yīng)，具有較高的平衡常數(shù)，需要由與其相偶聯(lián)的、熱力學(xué)上容易進(jìn)行的反應(yīng)驅(qū)動(dòng)； 限速步驟直接受制于該步驟酶活性

41、和酶蛋白合成的調(diào)節(jié)。,例如反饋抑制作用 生物化學(xué)的研究表明，反饋抑制作用具有三個(gè)明顯的特征：①只有代謝的終產(chǎn)物或它的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物具有反饋抑制作用；②受抑制的一般是代謝途徑的第一個(gè)酶；③反饋抑制作用是可逆的。由于這種抑制作用的可逆性，所以細(xì)胞才具有調(diào)節(jié)代謝的作用。只有代謝終產(chǎn)物存在一定水平時(shí)第一個(gè)酶才受到抑制，而當(dāng)終產(chǎn)物的濃度降到一定水平，第一個(gè)酶的活性由恢復(fù)了。,1、基本概念 1）代謝網(wǎng)絡(luò) 分解代謝途徑、合成代謝途徑

42、和膜輸送體系的有序組合構(gòu)成代謝網(wǎng)絡(luò)。廣義的代謝網(wǎng)絡(luò)包括物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)和能量代謝網(wǎng)絡(luò)。代謝網(wǎng)絡(luò)的組成取決于微生物的遺傳性能和微生物細(xì)胞所存在的環(huán)境,三、代謝網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)分析,代謝網(wǎng)絡(luò)主要由其核心部分和兩個(gè)在運(yùn)行時(shí)間上有交叉的部分組成。 (1)中心代謝途徑 (2) 指向中心代謝途徑, 并以中心代謝途徑中間化合物為接口的途徑 (收斂途徑)。 (3) 以中心代謝途徑的中間化合物為起點(diǎn), 從中心代謝途徑發(fā)散的

43、途徑(發(fā)散途徑)。,2）網(wǎng)絡(luò)剛性 生物細(xì)胞具有在代謝網(wǎng)絡(luò)某些節(jié)點(diǎn)處對(duì)抗代謝物流量改變的控制性能，而且這種代謝流分布（主要是碳架物質(zhì)流量分布）不會(huì)因終端產(chǎn)物對(duì)其合成途徑的反饋調(diào)節(jié)（反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簦┑慕獬l(fā)生重大的調(diào)整。 生物體固有的這種對(duì)代謝流量改變的抵抗能力稱(chēng)為代謝或代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性。,剛性的基礎(chǔ),雖然在生物合成過(guò)程中，胞內(nèi)代謝物濃度會(huì)波動(dòng)，但細(xì)胞的主要組成物質(zhì)(蛋白質(zhì)、RNA、DNA、脂質(zhì)等)在平衡生長(zhǎng)時(shí)維持一

44、定的相對(duì)比例，用于合成的單元代謝物如氨基酸、核苷酸、糖的磷酸酯等，能量如ATP等和生物合成還原力(如NADPH)等也近似地按化學(xué)計(jì)量的比例合成。,,雖然細(xì)胞代謝可支持完全不同的代謝流量分布以響應(yīng)各種環(huán)境刺激，但這樣的流量改變?nèi)匀灰С旨?xì)胞的主要組成物質(zhì)和代謝物群的合成，以便于細(xì)胞在該環(huán)境條件下生存下去。,如果某一特定代謝物過(guò)量合成，其所需要的初級(jí)代謝網(wǎng)絡(luò)某些途徑中的流量明顯不同于平衡生長(zhǎng)條件下對(duì)應(yīng)的流量，這時(shí)碳架物質(zhì)相對(duì)集中地經(jīng)載流途徑

45、流向該目的產(chǎn)物。載流途徑是代謝網(wǎng)絡(luò)中的一部分途徑首尾相銜接形成的一條從原料化合物到目的產(chǎn)物的途徑(它一般包括原料化合物(碳架物質(zhì))胞外降解和進(jìn)入細(xì)胞、碳架物質(zhì)經(jīng)胞內(nèi)進(jìn)一步降解或轉(zhuǎn)換存在方式進(jìn)入中心代謝途徑,中心代謝途徑的一部分，目的產(chǎn)物合成途徑，以及目的產(chǎn)物排出細(xì)胞等五個(gè)階段)。,例如以葡萄糖為主要碳源合成賴(lài)氨酸(Lys)時(shí)其載流途徑可簡(jiǎn)述為:葡萄糖→6-磷酸葡萄糖→3-磷酸甘油醛→磷酸烯醇式丙酮酸→草酰乙酸→天冬氨酸-B-半醛→

46、賴(lài)氨酸(胞內(nèi))→賴(lài)氨酸(胞外),這個(gè)載流途徑處于代謝網(wǎng)絡(luò)中，與網(wǎng)絡(luò)中的其它途徑有很多交叉，也就是說(shuō)載流途徑的許多中間化合物處于網(wǎng)絡(luò)的分叉處，兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)序列交匯或分流處被稱(chēng)為載流途徑上的節(jié)點(diǎn)（這也意味著碳架物質(zhì)流量可在節(jié)點(diǎn)處發(fā)生變化）。,主要節(jié)點(diǎn),雖然載流途徑的全部酶和蛋白質(zhì)(包括膜上載體蛋白)的活性控制著產(chǎn)物合成速率，但產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率控制主要取決于載流途徑上代謝中間物分支點(diǎn)即節(jié)點(diǎn)的流量分配功能?？砂旬a(chǎn)物形成時(shí)流量分配發(fā)生明顯改變的節(jié)點(diǎn)判

47、為主要節(jié)點(diǎn)。在賴(lài)氨酸合成的載流途徑中大約有30個(gè)節(jié)點(diǎn)，但當(dāng)賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)化率從35%升至75%時(shí)，流量分配的明顯改變僅發(fā)生在三個(gè)節(jié)點(diǎn)：6-磷酸葡萄糖，磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸。,代謝網(wǎng)絡(luò)與代謝工程的關(guān)系,代謝工程把細(xì)胞作為一個(gè)完整的單元來(lái)分析研究,它強(qiáng)調(diào)整個(gè)代謝(包括輸送、產(chǎn)能、生物合成、生物裝配等反應(yīng)途徑),而不是單個(gè)反應(yīng)。正因?yàn)槿绱?代謝工程涉及整個(gè)生物反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)以及途徑合成、熱力學(xué)可行性、途徑流量和流量控制等一系列問(wèn)題。,代謝工程要解

48、決的主要問(wèn)題是改變某些途徑中的碳架物質(zhì)流量或者改變碳架物質(zhì)流在不同途徑中的流量分布。代謝工程的目標(biāo)是修飾初級(jí)代謝,將碳架物質(zhì)流導(dǎo)入目的產(chǎn)物的載流途徑以獲得產(chǎn)物的最大轉(zhuǎn)化率。在大自然設(shè)定的條件下進(jìn)化而形成的代謝網(wǎng)絡(luò)對(duì)實(shí)際應(yīng)用中具有重要性的目的產(chǎn)物的過(guò)量合成來(lái)說(shuō),在遺傳上并不是最適的 。因此工業(yè)微生物學(xué)家試圖通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾來(lái)改變生物過(guò)程的運(yùn)行,以實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物的過(guò)量合成。,1）代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的基本類(lèi)型 代謝網(wǎng)絡(luò)和亞網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)

49、可以抽象為兩種基本類(lèi)型，即獨(dú)立型和依賴(lài)型 如果網(wǎng)絡(luò)或亞網(wǎng)絡(luò)中的每一個(gè)節(jié)點(diǎn)都依照化學(xué)計(jì)量規(guī)則將代謝物轉(zhuǎn)化為終端產(chǎn)物的組成部分，那么這樣的網(wǎng)絡(luò)或亞網(wǎng)絡(luò)就被認(rèn)為是依賴(lài)型的。,2、代謝網(wǎng)絡(luò)分析,,在這種網(wǎng)絡(luò)中，各分支途徑的代謝流均需達(dá)到化學(xué)計(jì)量的平衡，保證除終端產(chǎn)物之外的細(xì)胞內(nèi)代謝物不積累、不分泌。在此限制下，組成此網(wǎng)絡(luò)的全部主要節(jié)點(diǎn)處的流量分配必須協(xié)調(diào)，并且所有主要節(jié)點(diǎn)必須視為同樣重要。,反之，若由主要節(jié)點(diǎn)流出的代謝物

50、不能完全合成終端產(chǎn)物，則認(rèn)為該網(wǎng)絡(luò)是獨(dú)立型的。就此類(lèi)網(wǎng)絡(luò)而言，只要改變?cè)谀骋还?jié)點(diǎn)上的代謝物流量分配就有可能提高終端產(chǎn)物的產(chǎn)率。如果代謝網(wǎng)絡(luò)的主節(jié)點(diǎn)不集中，稱(chēng)為獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)，則可以通過(guò)對(duì)代謝途徑的修飾等來(lái)影響產(chǎn)物的積累,在一個(gè)簡(jiǎn)單的雙節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中,對(duì)于獨(dú)立型網(wǎng)絡(luò),節(jié)點(diǎn)1或2處的流量分配向有利于形成產(chǎn)物P的方向改變，能提高目的產(chǎn)物P的轉(zhuǎn)化率；但在依賴(lài)型網(wǎng)絡(luò)中，若要提高轉(zhuǎn)化率，這兩個(gè)節(jié)點(diǎn)的流量分配都必須改變。,2）節(jié)點(diǎn)的分類(lèi) 根據(jù)

51、節(jié)點(diǎn)處代謝流量的調(diào)控機(jī)制及其特性，可將節(jié)點(diǎn)分為三類(lèi)。 （1）柔性節(jié)點(diǎn)（Flexible Node） （2）強(qiáng)剛性節(jié)點(diǎn)（Strongly Rigid Node） （3）弱剛性節(jié)點(diǎn)（Weakly Rigid Node）,（1）柔性節(jié)點(diǎn)（Flexible Node） 若流經(jīng)每一分支的流量容易改變以滿(mǎn)足代謝需求，則這樣的節(jié)點(diǎn)成為柔性節(jié)點(diǎn)，導(dǎo)向每一分支的反應(yīng)速度也相近，每一分支的流量受相應(yīng)的終端產(chǎn)物反饋抑制控制，節(jié)

52、點(diǎn)的力量分割率可以從零變化到滿(mǎn)足合成末端產(chǎn)物所需求的水平。 對(duì)于分支流量分布的改變，柔性節(jié)點(diǎn)是最“順從”的。換言之，在柔性節(jié)點(diǎn)，主副產(chǎn)物均有自身反饋抑制，流量容易改變。,解除一個(gè)分支的反饋抑制可提高分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量，即柔性分支點(diǎn)傾向于更適應(yīng)通量分配比的變化,柔性節(jié)點(diǎn)的主要特點(diǎn)是經(jīng)受得起流量分配的改變，而且這種改變幾乎不需要特殊的修飾，因此許多希望增加產(chǎn)物產(chǎn)率的代謝修飾均建立在主要節(jié)點(diǎn)為柔性的基礎(chǔ)之上。許多研究表明，氨基酸

53、生物合成途徑中的許多分支節(jié)點(diǎn)均具有這種柔性，這對(duì)于利用代謝工程技術(shù)改良氨基酸產(chǎn)生菌的性能來(lái)說(shuō)是非常重要的。,（2）強(qiáng)剛性節(jié)點(diǎn)（Strongly Rigid Node） 若一個(gè)節(jié)點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)分支途徑的流量分割率受到嚴(yán)格控制，那么這類(lèi)節(jié)點(diǎn)就稱(chēng)為強(qiáng)剛性節(jié)點(diǎn)。 也就是說(shuō)，強(qiáng)剛性節(jié)點(diǎn)的流量分配是很難改變的，除非對(duì)相關(guān)分支途徑中的各種酶動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行全方位的修飾才可實(shí)現(xiàn)。換言之，在強(qiáng)剛性節(jié)點(diǎn)，主、副產(chǎn)物均有反饋抑制，相互有激活作用

54、，流量穩(wěn)定且難以改變。,（3）弱剛性節(jié)點(diǎn)（Weakly Rigid Node） 若一個(gè)節(jié)點(diǎn)的流量分配由它的某一分支途徑的分支動(dòng)力學(xué)所控制，則稱(chēng)該節(jié)點(diǎn)是弱剛性節(jié)點(diǎn),由于代謝網(wǎng)絡(luò)中剛性節(jié)點(diǎn)的存在，對(duì)為提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率而進(jìn)行的干擾的結(jié)果產(chǎn)生復(fù)雜的影響。,主要節(jié)點(diǎn)剛性和評(píng)估,一旦網(wǎng)絡(luò)中關(guān)于目的產(chǎn)物的主要節(jié)點(diǎn)已被識(shí)別,必須對(duì)它們的剛性程度進(jìn)行評(píng)估。若能獲得生物體的生物化學(xué)的網(wǎng)絡(luò)圖表中全部酶的詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)表達(dá)式,則可建立一個(gè)關(guān)于代謝的

55、數(shù)學(xué)模型。借助這一模型,用代謝網(wǎng)絡(luò)或亞網(wǎng)絡(luò)的模型通過(guò)比較對(duì)主要節(jié)點(diǎn)的剛性進(jìn)行評(píng)估。,,即通過(guò)比較在穩(wěn)定狀態(tài)下的流量分配和為提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率而進(jìn)行的干擾下同一網(wǎng)絡(luò)中的流量分配進(jìn)行評(píng)估。在已確定主要代謝節(jié)點(diǎn)的類(lèi)型的基礎(chǔ)上提出代謝改變的方案。以模擬為基礎(chǔ)的評(píng)估技術(shù)的明顯缺點(diǎn)是關(guān)于動(dòng)力學(xué)的詳細(xì)信息是有限的，即使有了動(dòng)力學(xué)信息，其在活體中的應(yīng)用也并不是容易建立的。,,主要節(jié)點(diǎn)上流量分配限制產(chǎn)物生產(chǎn)能力的程度可通過(guò)對(duì)靠近此節(jié)點(diǎn)的一個(gè)分支進(jìn)行干擾，對(duì)

56、所得的本區(qū)域流量分布和在額定條件下的觀(guān)察到的對(duì)應(yīng)數(shù)值進(jìn)行比較，從而得到評(píng)估結(jié)果。若該節(jié)點(diǎn)處的流量分配能對(duì)干擾作出響應(yīng)而明顯改變方向和大小，則認(rèn)為此節(jié)點(diǎn)是柔性的或是弱剛性的。反之，節(jié)點(diǎn)可能是強(qiáng)剛性的。,適合于產(chǎn)物合成的代謝流量的分析揭示，流量分配的修飾只需要發(fā)生在網(wǎng)絡(luò)的主要節(jié)點(diǎn)處。對(duì)它的遺傳修飾既可以用遺傳工程的方法,也可以用應(yīng)用分子生物學(xué)有關(guān)的“誘變—篩選”方法進(jìn)行。如果在發(fā)酵生產(chǎn)中，也可以采取工藝措施，調(diào)整載流途徑上的流量。,代