代謝工程概述

1、代謝工程( Metabolic Engineering ),2,第一節(jié) 代謝工程概述,現(xiàn)代生物技術(shù)手段主要包括：基因工程 (Gene Engineering)細胞工程 (Cell Engineering)發(fā)酵工程 (Fermentation Engineering)酶工程 (Enzyme Engineering),現(xiàn)代生物技術(shù)在化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)林牧漁、輕工食品、能源和環(huán)境等領(lǐng)域都將發(fā)揮重要作用，可促進傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的改造和新

2、型產(chǎn)業(yè)的形成，對人類社會產(chǎn)生深遠影響。其中發(fā)酵工程是生物技術(shù)的重要組成部分，是生物技術(shù)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品的重要環(huán)節(jié)。20世紀(jì)90年代提出的代謝工程發(fā)展迅速，被視為繼傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)多肽單基因表達（第一代基因工程）、基因定向突變（第二代基因工程）之后的第三代基因工程。,代謝工程的產(chǎn)生,微生物發(fā)酵已經(jīng)有幾千年的歷史，早在2000多年以前，人們就開始利用微生物進行白酒、黃酒、葡萄酒、啤酒和清酒等的發(fā)酵，此時的發(fā)酵被稱為天然發(fā)酵時代。20世紀(jì)40年

3、代，隨著抗生素青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)的大規(guī)模進行，開始了現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)時代。通過自然選擇的方法，人們用10-6的突變幾率來篩選所謂的高產(chǎn)菌株。由于沒有代謝控制發(fā)酵理論作為指導(dǎo)，直到20世紀(jì)60年代現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)仍處于盲目階段。,1956年，日本木下祝朗博士等從東京上野動物園鳥糞中分離篩選到谷氨酸產(chǎn)生菌，1957年日本協(xié)和發(fā)酵公司成功地進行谷氨酸發(fā)酵，這是整個氨基酸發(fā)酵的開始，繼而迅速掀起了一股氨基酸發(fā)酵研究的熱潮。隨著對代謝發(fā)酵理論的深入研究，轉(zhuǎn)

4、向發(fā)酵菌株本身的研究，獲得了很多的氨基酸高產(chǎn)菌株。隨后，核酸類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生菌也以代謝控制發(fā)酵理論為指導(dǎo)進行選育，并奮起直追成為后起之秀。,5,家有味之素,白水變雞汁,日本東京帝國大學(xué)的教授池田菊苗，1909年,中國，味精，吳蘊初，1923年,,氨基酸和核苷酸發(fā)酵的研究進一步推動了抗生素發(fā)酵的研究與生產(chǎn)，發(fā)酵由野生型發(fā)酵向高度人為控制的發(fā)酵轉(zhuǎn)移；由依賴于微生物分解代謝的發(fā)酵轉(zhuǎn)向依賴于生物合成的發(fā)酵，即向代謝產(chǎn)物大量積累的方向轉(zhuǎn)移。,,

5、代謝控制發(fā)酵就是利用遺傳學(xué)的方法或生物化學(xué)方法，人為地在DNA分子水平上改變和控制微生物的代謝，使得目的產(chǎn)物大量的生成、積累的發(fā)酵。代謝控制發(fā)酵的核心：解除微生物代謝控制機制，打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，人為地控制微生物的代謝。,,隨著代謝控制發(fā)酵理論的逐漸完善，目前已發(fā)展出一個重要的研究分支——代謝工程。它是近年來分子生物學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)工程學(xué)和計算機科學(xué)的發(fā)展與交叉的產(chǎn)物，從而使生物技術(shù)突飛猛進的發(fā)展，使有關(guān)的研究進入了細胞

6、水平。從細胞的代謝途徑出發(fā)，運用工程學(xué)原理進行代謝調(diào)控，使之向產(chǎn)物積累的方向發(fā)展，由此創(chuàng)建了一個新興的領(lǐng)域，即“代謝工程”。,代謝工程的理論首先由Jay Bailey于1991年在“Science”雜志上論述了代謝工程的應(yīng)用、潛力和設(shè)計。同年，Greg Stephanopoulos和Joseph Vallino在“Science”雜志上論述了有關(guān)“過量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物時的代謝工程”、“代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性、代謝流的分配、關(guān)鍵分叉點及速度限制步

7、驟”等內(nèi)容。 代謝工程也被稱為“途徑工程”，是基因工程的重要分支。,隨著DNA重組技術(shù)的日趨成熟，代謝工程的理論和應(yīng)用得到了發(fā)展。代謝工程定義的演變過程如下：（1）1988年MacQuitty指出，微生物途徑工程(Microbial Pathway engineering)是利用DNA重組技術(shù)修飾各種代謝途徑（包括生物體非固有的代謝途徑），提高特定代謝物的產(chǎn)量。（2）1991年Bailey將代謝工程(Metabolic eng

8、ineering)定義為：利用DNA重組技術(shù)優(yōu)化細胞的酶活、轉(zhuǎn)運和調(diào)控功能，提高細胞活力。,（3）1991年Tong等將代謝途徑工程(Metabolic pathway engineering)定義：生化途徑的修飾、設(shè)計與構(gòu)建。 （4）1993年Cameron認為，代謝工程(Metabolic Engineering)是利用DNA重組技術(shù)對代謝進行目的性修飾。（5）1994年P(guān)ieperberg認為代謝工程/途徑工程(Pathway

9、 engineering/Metabolic design)是改造細胞代謝途徑，提高天然最終產(chǎn)物產(chǎn)量或合成新產(chǎn)物包括中間產(chǎn)物或修飾型最終產(chǎn)物。,（6）1994年Gregory將代謝工程(Metabolic Engineering)定義：代謝工程是對生化反應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)進行目的性修飾。（7）1996年William將代謝工程(Metabolic Engineering)定義：為達到所需目的，對活細胞的代謝途徑進行修飾。（8）1999年K

10、offasl將代謝工程(Metabolic Engineering)定義：利用分子生物學(xué)原理系統(tǒng)分析代謝途徑，設(shè)計合理的遺傳修飾戰(zhàn)略從而優(yōu)化細胞生物學(xué)特性。,代謝工程較系統(tǒng)的定義 應(yīng)用重組DNA技術(shù)和應(yīng)用分析生物學(xué)相關(guān)的遺傳學(xué)手段進行有精確目標(biāo)的遺傳操作，改變酶的功能或輸送體系的功能，甚至產(chǎn)能系統(tǒng)的功能，以改進細胞某些方面的代謝活性的整套操作工作（包括代謝分析、代謝設(shè)計、遺傳操作、目的代謝活性的實現(xiàn)）。 簡而言之，

11、代謝工程是生物化學(xué)反應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)有目的的修飾。 代謝工程要解決的主要問題就是改變某些途徑中的碳架物質(zhì)流量或改變碳架物質(zhì)流在不同途徑中的流量分布。其目標(biāo)就是修飾初級代謝，將碳架物質(zhì)流導(dǎo)入目的產(chǎn)物的載流途徑以獲得產(chǎn)物的最大轉(zhuǎn)化率。,,代謝工程的主要特征就是利用DNA重組技術(shù)，重建代謝網(wǎng)絡(luò)，改變代謝流及分支代謝速度，以改進代謝產(chǎn)物及蛋白類產(chǎn)品，由于外源DNA的引入擴展了固有的代謝途徑，獲得了新的化學(xué)物質(zhì)。改變轉(zhuǎn)化蛋白的過程，減少

12、不必要的廢物。例如，谷氨酸發(fā)酵,代謝工程的研究內(nèi)容,1、代謝流的定量和定向 （1）流量評計原理 A 基于模型動力學(xué) B 控制理論 C 示蹤實驗（2）代謝流的定向 A 利用環(huán)境控制 B 改變細胞組成的控制 C 代謝流向的目標(biāo)產(chǎn)物的增加,2 、細胞對底物的吸收和產(chǎn)品的釋放模型及分析 （1）轉(zhuǎn)運過

13、程的生物化學(xué) A 轉(zhuǎn)運蛋白機制：載體通道泵 B 轉(zhuǎn)運動力學(xué) C 載體媒介轉(zhuǎn)運的能量方面：偶聯(lián)的概念 D 細胞轉(zhuǎn)運活性的調(diào)節(jié)（2）研究方法方面 A 轉(zhuǎn)運過程的實驗分析 B 擴散和載體媒介轉(zhuǎn)運間的區(qū)別 C 轉(zhuǎn)運過程動力學(xué)分析 D 生物過程中的轉(zhuǎn)運分析,3、研究胞內(nèi)代謝物濃度的反應(yīng)工程方法 （1）用于胞內(nèi)核磁共振研

14、究的反應(yīng)工程 （2）胞內(nèi)代謝物分析快速反應(yīng)取樣的反應(yīng)工程4、 用13C標(biāo)記實驗進行胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)流分析 （1）穩(wěn)態(tài)流分析 （2）測定穩(wěn)態(tài)胞內(nèi)數(shù)據(jù) （3）代謝物13C標(biāo)記系統(tǒng)的模型 （4）模擬和數(shù)據(jù)分析 （5）穩(wěn)態(tài)標(biāo)記系統(tǒng)的綜合分析,代謝工程的研究手段,1、采用遺傳學(xué)手段的遺傳操作 （1）基因工程技術(shù)的應(yīng)用 （2）常規(guī)誘變技術(shù)的應(yīng)用 2、 生物合成途徑的代謝調(diào)控

15、 （1）生物合成中間產(chǎn)物的定量生物測定 （2）共合成法在生物合成中的應(yīng)用 （3）酶的誘導(dǎo)合成和分解代謝產(chǎn)物阻遏,,3、研究生物合成機制的常用方法 （1）刺激實驗法 （2）同位素示蹤法 （3）洗滌菌絲懸浮法 （4）無細胞抽提法 （5）遺傳特性誘變法,,刺激實驗法：在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入某些可能是前體的物質(zhì)，觀察該物質(zhì)在發(fā)酵過程中的被利用情況與促進目的

16、產(chǎn)物生成的效果。洗滌菌絲法（或稱靜息細胞法）：取不同生長階段的菌絲，先洗去沾染的原培養(yǎng)基成分及代謝產(chǎn)物，然后將菌絲懸浮于人工培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，在一定條件下繼續(xù)觀察被試驗的化合物對菌體代謝和對產(chǎn)物合成的影響。,,無細胞抽提法：用適當(dāng)?shù)姆椒◤募毎蟹蛛x純化制得純酶。將制得的純酶和有關(guān)物質(zhì)加入到反應(yīng)體系、進行酶促反應(yīng)，檢測反應(yīng)體系中的底物和產(chǎn)物濃度，判斷該酶是否催化目的產(chǎn)物的生物合成。,具體來講，代謝工程的研究方法如下：1、分子生物學(xué)方法：構(gòu)

17、建特殊的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，尤其對于具有較高生產(chǎn)價值的微生物，具有重要意義。例如Backman等利用切割載體獲得酪氨酸(Tyr)營養(yǎng)缺陷型，為構(gòu)建苯丙氨酸的生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。,,2、分析化學(xué)及檢測方法：代謝工程的研究對象是代謝途徑，因此必須對代謝通路中的一些酶及產(chǎn)物進行研究和分析。傳統(tǒng)的分析通路阻斷的手段有：物質(zhì)平衡、同位素標(biāo)記、分析障礙突變體等，目前它們?nèi)匀皇潜夭豢缮俚氖侄?，而核磁共振、流式細胞術(shù)的應(yīng)用則為這一領(lǐng)域的發(fā)展增添了新的活力。,,

18、3、數(shù)學(xué)及計算機工具：研究代謝工程不僅需要遺傳學(xué)知識，而且需要對寄主菌的生化代謝途徑和生理學(xué)有深入的理解，所以將DNA數(shù)據(jù)庫的信息應(yīng)用于代謝工程并開發(fā)出適合的軟件系統(tǒng)是十分必要的，Karp等構(gòu)建了981個生命體化合物數(shù)據(jù)庫，為未來的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。人們已在實驗的基礎(chǔ)上結(jié)合數(shù)學(xué)和化學(xué)的理論，發(fā)展了一些人工智能程序。,KEGG數(shù)據(jù)庫,http://www.genome.jp/kegg/,代謝工程的三個基本觀點,在生物工程受到廣泛重視的今天，

19、有必要把微生物(菌種選育)、微生物學(xué)過程(發(fā)酵工藝)和微生物學(xué)體系(生物反應(yīng)器)作為一個整體，在科學(xué)的水平上對工業(yè)發(fā)酵進行重新審視。從工業(yè)發(fā)酵的現(xiàn)狀出發(fā)，主要根據(jù)對碳元素代謝及其控制，菌種是化能異養(yǎng)型微生物，產(chǎn)物是微生物細胞排出細胞的代謝中間產(chǎn)物的工業(yè)發(fā)酵，提出了3個基本觀點。,1.生物能支撐觀點微生物細胞是工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)者，微生物細胞的生長和維持需要由其自身的能量轉(zhuǎn)換機構(gòu)或從其他形式的能量轉(zhuǎn)化形成的生物能來支撐。因此，工業(yè)

20、發(fā)酵具有生物學(xué)屬性。2.代謝網(wǎng)絡(luò)觀點由生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和跨輸送步驟組成的代謝網(wǎng)絡(luò)既沒有絕對的起點，也沒有絕對的終點。代謝網(wǎng)絡(luò)中任何一種中間產(chǎn)物(或可借助生物學(xué)、化學(xué)方法與代謝網(wǎng)絡(luò)聯(lián)網(wǎng)的任何一種化合物)都可能被開發(fā)成為工業(yè)發(fā)酵的目的產(chǎn)物或原料。,,3.細胞經(jīng)濟觀點微生物細胞的經(jīng)濟性是在自然選擇的過程中逐漸形成的。野生的(未經(jīng)人工變異的)微生物細胞在自然選擇的過程中逐漸形成競爭型的細胞經(jīng)濟。而工業(yè)發(fā)酵往往要以目的產(chǎn)物的生產(chǎn)為主導(dǎo)，

21、調(diào)整代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝流，構(gòu)建一種導(dǎo)向型細胞經(jīng)濟。從競爭型細胞經(jīng)濟的轉(zhuǎn)變?nèi)Q于遺傳和環(huán)境因素的信息導(dǎo)向，這種導(dǎo)向必須遵循細胞經(jīng)濟的基本運行規(guī)律。,第二節(jié) 代謝工程的基本理論,一、基本概念二、代謝物流及其相關(guān)特性三、代謝網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)分析,,,,向心途徑,中心代謝途徑,離心途徑,碳架物質(zhì)從向心板塊注入中心板塊時所流經(jīng)的代謝途徑統(tǒng)稱向心途徑。在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)器中的微生物細胞的代謝是分步進行的。胞外營養(yǎng)物質(zhì)(一般要經(jīng)胞外酶降解后)從培養(yǎng)

22、介質(zhì)跨膜進入細胞，(一般要)經(jīng)過“向心途徑”、“中心途徑”和“離心途徑”等連續(xù)的代謝途徑的代謝，才能在胞內(nèi)生成目的產(chǎn)物，最后，目的產(chǎn)物跨過細胞質(zhì)膜排出細胞回到培養(yǎng)介質(zhì)中。,1、胞外酶對原料的降解及營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的過程2、經(jīng)胞內(nèi)降解代謝途徑匯入中心代謝途徑3、中心代謝途徑及其控制4、合成代謝流及其控制5、目的產(chǎn)物的跨膜及其控制,,典型的理想載流途徑應(yīng)該由以上五段承擔(dān)不同代謝分工的依次銜接的代謝途徑組成。這就是載流途徑的“五段式”

23、。在這條載流途徑上流動的代謝主流對應(yīng)地也有五段，這就是代謝主流的“五段式”。,一、基本概念,1）底物 培養(yǎng)基中存在的化合物，是能被細胞進一步代謝或直接構(gòu)成細胞組分。碳源、氮源、能源以及能滿足細胞功能必須的各種礦物元素均屬于細胞代謝的底物。葡萄糖作為細胞生長的主要碳源，是最常見的底物。 2）代謝產(chǎn)物 由細胞合成并分泌到細胞外培養(yǎng)基中的化合物，可以是初級代謝產(chǎn)物（如二氧化碳、乙醇等），也可以是次級代謝產(chǎn)物或蛋白質(zhì)。

24、 3）生物基質(zhì)要素 構(gòu)成生物基質(zhì)大分子池的一類物質(zhì)，包括RNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物等。,4）胞內(nèi)代謝物 是細胞內(nèi)其他化合物，包括不同代謝途徑的中間代謝物和用于大分子合成的結(jié)構(gòu)單元等。 5）途徑 是指催化總的代謝物的轉(zhuǎn)化、信息傳遞和其他細胞功能的酶促反應(yīng)的集合 6）生化反應(yīng)途徑和代謝途徑 一系列按序進行的生物化學(xué)反應(yīng)途徑。若這條途徑在活細胞里運行，則為代謝途徑。,7）生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)

25、生化反應(yīng)途徑按生物化學(xué)規(guī)律匯成生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。 8）代謝網(wǎng)絡(luò) 分解代謝途徑、合成代謝途徑和膜輸送體系的有序組合構(gòu)成代謝網(wǎng)絡(luò)。廣義的代謝網(wǎng)絡(luò)包括物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)和能量代謝網(wǎng)絡(luò)。代謝網(wǎng)絡(luò)的組成取決于微生物的遺傳特性和微生物細胞存在的環(huán)境。,葡萄糖琥珀酸 草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸 乳酸

26、 丙酮酸 乙醛 乙酰 CoA 甲酸 乙醇 乙酰磷酸 CO2 H2

27、 乙酸,,,,,,,,,,,,,,,,丙酮酸甲酸裂解酶,乳酸脫氫酶,甲酸-氫裂解酶,磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶,乙酸激酶,PEP羧化酶,乙醛脫氫酶,+2H,pH﹤6.2,乙醇脫氫酶,9）代謝網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)網(wǎng) 代謝中間化合物都在代謝網(wǎng)絡(luò)上，有些有機化合物雖然不在網(wǎng)絡(luò)上但仍有可能與代謝網(wǎng)絡(luò)聯(lián)網(wǎng)。所謂“聯(lián)網(wǎng)”，就是用化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)把指定的化合物連接到代謝網(wǎng)絡(luò)上去，從而使它與微生物的代謝建立聯(lián)系。 聯(lián)網(wǎng)可以用化學(xué)或生物學(xué)方法（

28、含重組DNA技術(shù)）實現(xiàn)。廣義的聯(lián)網(wǎng)包含生命有機體之間接力賽式的代謝聯(lián)系。已在網(wǎng)絡(luò)上或者可以聯(lián)網(wǎng)的化合物都可能開發(fā)成為發(fā)酵工業(yè)的產(chǎn)物或原料。,①必須遵循細胞物質(zhì)代謝規(guī)律及途徑組合的生物化學(xué)原理，它提供了生物體的基本代謝圖譜及其生化反應(yīng)的分子機理。 ②必須遵循細胞代謝流及控制分析的化學(xué)計量學(xué)、分子反應(yīng)動力學(xué)、熱力學(xué)以及控制學(xué)原理。這是代謝途徑改造的理論依據(jù)。 ③必須遵循途徑代謝流推動力的酶學(xué)原理，包括酶促反應(yīng)動力學(xué)、

29、變構(gòu)抑制效應(yīng)、修飾激活效應(yīng)等。,代謝工程應(yīng)遵循的基本原理,代謝工程是多學(xué)科高度交叉的新興領(lǐng)域，主要目標(biāo)是通過定向重組代謝網(wǎng)絡(luò)，從而達到改良生物體遺傳性狀的目的。為此，它必須遵循下列基本原理：,④必須遵循基因操作與控制的分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)原理，它們需要已闡明的基因表達的基本規(guī)律，同時也提供了基因操作的一整套相關(guān)技術(shù)。⑤必須遵循細胞生理狀態(tài)平衡的細胞生理學(xué)原理，它為細胞代謝機制提供了一個全景式的描述，因此是一個代謝速率和生理狀態(tài)表征

30、研究的平臺。,⑥必須遵循發(fā)酵或細胞培養(yǎng)的工藝學(xué)和工程控制的生化工程和化學(xué)工程原理。 化學(xué)工程無疑是將工程方法運用與生物系統(tǒng)研究的最合適的渠道。從一般意義上來說，這種方法在生物系統(tǒng)的研究中融入了綜合、定量、相關(guān)等概念。更為重要的是，它為速率受限制的系統(tǒng)分析提供了獨特的工具和經(jīng)驗，因此在代謝工程領(lǐng)域中具有舉足輕重的意義。,⑦必須遵循有關(guān)生物信息收集分析與應(yīng)用的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)原理。 隨著基因組計劃的深入發(fā)展，各生物物種的

31、基因物理信息與其生物功能信息在此交匯，并為代謝網(wǎng)絡(luò)設(shè)計提供了更為廣闊的展示平臺。這是代謝工程技術(shù)迅猛發(fā)展和廣泛應(yīng)用的最大推動力。,1、基本概念 1）代謝流和碳架物質(zhì)流 代謝物在代謝途徑中流動形成代謝流。具體地說，處于一定環(huán)境條件下的微生物培養(yǎng)物中，參與代謝的物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡(luò)中按一定規(guī)律流動，形成微生物的代謝流。代謝流具備流體流動的一些基本屬性，如方向性、連續(xù)性、有序性、可調(diào)性等，也可以接受疏導(dǎo)、阻塞、分流、匯流等“治理”，也可

32、能發(fā)生“干枯”或“溢出”等現(xiàn)象。在代謝工程領(lǐng)域，代謝流往往是指碳架物質(zhì)流。,二、代謝物流及其相關(guān)特性,2）代謝主流 在一定的培養(yǎng)條件下，代謝物在代謝網(wǎng)絡(luò)中流動，流量相對集中的代謝流叫做該條件下的代謝主流。 代謝途徑（網(wǎng)絡(luò)）的延伸和剪接都可能改變代謝主流，從而實現(xiàn)新基質(zhì)的利用和新產(chǎn)品的開發(fā)。代謝主流的流量測定是代謝工程的重要組成部分。,3）載流途徑 代謝主流流經(jīng)的代謝途徑為主要載流途徑，簡稱載流途徑。在代謝工程領(lǐng)域，是指

33、碳流在代謝網(wǎng)絡(luò)中通過的主要途徑，即生產(chǎn)所需產(chǎn)物期間讓碳流相對集中流向產(chǎn)物合成的途徑。,碳架代謝的三個子系統(tǒng)微生物碳架物質(zhì)的初級代謝大致可分成三個子系統(tǒng)，一個分解代謝子系統(tǒng)（子系統(tǒng)Ⅰ）和兩個合成代謝子系統(tǒng)（子系統(tǒng)Ⅱ分子模塊的合成代謝子系統(tǒng)和子系統(tǒng)Ⅲ生物大分子的代謝合成子系統(tǒng)）。,ATP代表代謝能，分子模塊代表氨基酸、核苷酸等參與生物大分子組成的單元化合物，碳架代表PYR，R-5-P，α-KG 等前體代謝物。虛箭頭和實箭頭分別代表代謝系統(tǒng)

34、內(nèi)部的松散的和緊密的聯(lián)系。,子系統(tǒng) Ⅰ（碳源的分解代謝子系統(tǒng)）微生物細胞用以合成前體代謝物和提供代謝能的碳源分解代謝系統(tǒng)。這個系統(tǒng)最容易直接受外界環(huán)境條件在生理許可范圍內(nèi)的影響?？赡苁且驗樘荚吹姆纸獯x有多條途徑可供選擇；此外，可能是因為分解代謝的酶主要分布在細胞內(nèi)可溶部分和膜上，易受外界條件影響。,② 子系統(tǒng) Ⅱ（ 合成分子模塊的子系統(tǒng)） 微生物細胞用以合成生物大分子的標(biāo)準(zhǔn)單元的合成代謝系統(tǒng)。所謂分子模塊一般是指用于多糖合成的

35、G-1-P， 用于蛋白質(zhì)合成的各種氨基酸，用于RNA 和 DNA 合成的各種核苷酸和脫氧核苷酸，以及用于類異戊二烯化合物合成的異戊烯基焦磷酸等。,③子系統(tǒng)Ⅲ：生物大分子合成代謝子系統(tǒng) 用以生成蛋白質(zhì)、DNA 、RNA 、各種多糖 ( 同多糖、雜多糖、肽多糖、脂多糖、莢膜多糖等) 及類脂（ 含類異戊二烯化合物）等細胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生物大分子合成代謝系統(tǒng)。,只有當(dāng)以上三個代謝子系統(tǒng)作為一個整體來運行，微生物細胞才能維持生命循環(huán)。只有當(dāng)生命循

36、環(huán)得到維持，我們才有可能通過微生物細胞的生命活動，生產(chǎn)微生物產(chǎn)品。,三子系統(tǒng)之間的關(guān)系： 子系統(tǒng)Ⅰ生成 ATP, 子系統(tǒng) Ⅱ和Ⅲ使用ATP。但是子系統(tǒng)Ⅰ中ATP如何合成并不嚴(yán)重影響子系統(tǒng)Ⅱ和子系統(tǒng) Ⅲ 對ATP 的使用。 因此可以認為子系統(tǒng) Ⅰ與整個合成系統(tǒng) （ Ⅱ + Ⅲ ） 之間的聯(lián)系是較為松散的。子系統(tǒng)Ⅰ 生成的前體代謝物的質(zhì)和量強烈地影響子系統(tǒng)Ⅱ的運行，因此子系統(tǒng)Ⅰ與 Ⅱ之間的聯(lián)系是緊密的 。子系統(tǒng) Ⅰ 與 Ⅲ 之間幾

37、乎僅僅通過 ATP 相聯(lián)系， 因此Ⅰ 與 Ⅲ之間的聯(lián)系是松散的。 分子模塊 ( 如氨基酸 ) 在細胞內(nèi)通?？梢杂坞x狀態(tài)存在，由此推測，子系統(tǒng)Ⅱ與 Ⅲ 也只是松散的關(guān)系。,子系統(tǒng)Ⅰ和子系統(tǒng)Ⅱ 分別與子系統(tǒng) Ⅲ 只發(fā)生松散的聯(lián)系，這就是子系統(tǒng)Ⅰ具有相對獨立的運轉(zhuǎn)（ 排出能量代謝副產(chǎn)物）能力的原因之一，也是 “ 子系統(tǒng)Ⅰ+ 子系統(tǒng)Ⅱ” 作為一個整體具有相對獨立的運轉(zhuǎn)（排出分子模塊）能力的原因之一。,相對獨立運行的另一個重要原因是細胞

38、的分泌機制。子系統(tǒng)Ⅰ相對獨立運轉(zhuǎn)的過程中，細胞可能分泌乙醇等能量代謝的副產(chǎn)物； “ 子系統(tǒng)Ⅰ+ 子系統(tǒng)Ⅱ ” 相對獨立運轉(zhuǎn)的過程中，細胞可能分泌氨基酸等分子模塊；三個子系統(tǒng)協(xié)調(diào)運轉(zhuǎn)，微生物細胞生長迅速。還有可能分泌酶、多糖、多肽等生物大分子，同時放慢生長速度。,4）代謝主流的變動性和選擇性 微生物的代謝主流處于不斷變化之中，其方向、流量甚至代謝主流的載流途徑都可能發(fā)生變化。這就是微生物代謝主流的變動性和代謝主流對代謝網(wǎng)絡(luò)途徑的

39、選擇性。這種變動和選擇的根據(jù)在于微生物細胞的遺傳物質(zhì)，選擇的原因是微生物所處的環(huán)境條件的變化。,5）理想載流途徑 為了提高產(chǎn)物對原料的轉(zhuǎn)化率，要求代謝主流（根據(jù)代謝分析的結(jié)果）從設(shè)定的途徑流過，是它成為載流途徑。因為這樣的載流途徑是帶有主觀導(dǎo)向性的虛擬的載流途徑，所以把它稱為理想載流途徑。,1）代謝物流與酶的關(guān)系 在代謝工程中，把酶促反應(yīng)看作代謝系統(tǒng)的基本組成部分，而把基因、酶的水平、代謝物濃度、抑制機制、效應(yīng)物、抑制

40、劑與激活劑、環(huán)境條件等的影響歸結(jié)為對酶促反應(yīng)的擾動。,2、代謝物流的相關(guān)特性,2）物流限制 人們一直認為代謝途徑存在著固有的限速步驟，它們控制著流經(jīng)代謝途徑的代謝物流，其主要特征表現(xiàn)在： 限速步驟的反應(yīng)速度很低，整個系統(tǒng)的代謝物流取決于催化該反應(yīng)步驟的酶活性； 限速步驟是熱力學(xué)不可行的反應(yīng)，具有較高的平衡常數(shù)，需要由與其相偶聯(lián)的、熱力學(xué)上容易進行的反應(yīng)驅(qū)動； 限速步驟直接受制于該步驟酶活性

41、和酶蛋白合成的調(diào)節(jié)。,例如反饋抑制作用 生物化學(xué)的研究表明，反饋抑制作用具有三個明顯的特征：①只有代謝的終產(chǎn)物或它的結(jié)構(gòu)類似物具有反饋抑制作用；②受抑制的一般是代謝途徑的第一個酶；③反饋抑制作用是可逆的。由于這種抑制作用的可逆性，所以細胞才具有調(diào)節(jié)代謝的作用。只有代謝終產(chǎn)物存在一定水平時第一個酶才受到抑制，而當(dāng)終產(chǎn)物的濃度降到一定水平，第一個酶的活性由恢復(fù)了。,1、基本概念 1）代謝網(wǎng)絡(luò) 分解代謝途徑、合成代謝途徑

42、和膜輸送體系的有序組合構(gòu)成代謝網(wǎng)絡(luò)。廣義的代謝網(wǎng)絡(luò)包括物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)和能量代謝網(wǎng)絡(luò)。代謝網(wǎng)絡(luò)的組成取決于微生物的遺傳性能和微生物細胞所存在的環(huán)境,三、代謝網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)分析,代謝網(wǎng)絡(luò)主要由其核心部分和兩個在運行時間上有交叉的部分組成。 (1)中心代謝途徑 (2) 指向中心代謝途徑, 并以中心代謝途徑中間化合物為接口的途徑 (收斂途徑)。 (3) 以中心代謝途徑的中間化合物為起點, 從中心代謝途徑發(fā)散的

43、途徑(發(fā)散途徑)。,2）網(wǎng)絡(luò)剛性 生物細胞具有在代謝網(wǎng)絡(luò)某些節(jié)點處對抗代謝物流量改變的控制性能，而且這種代謝流分布（主要是碳架物質(zhì)流量分布）不會因終端產(chǎn)物對其合成途徑的反饋調(diào)節(jié)（反饋抑制和反饋阻遏）的解除而發(fā)生重大的調(diào)整。 生物體固有的這種對代謝流量改變的抵抗能力稱為代謝或代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性。,剛性的基礎(chǔ),雖然在生物合成過程中，胞內(nèi)代謝物濃度會波動，但細胞的主要組成物質(zhì)(蛋白質(zhì)、RNA、DNA、脂質(zhì)等)在平衡生長時維持一

44、定的相對比例，用于合成的單元代謝物如氨基酸、核苷酸、糖的磷酸酯等，能量如ATP等和生物合成還原力(如NADPH)等也近似地按化學(xué)計量的比例合成。,,雖然細胞代謝可支持完全不同的代謝流量分布以響應(yīng)各種環(huán)境刺激，但這樣的流量改變?nèi)匀灰С旨毎闹饕M成物質(zhì)和代謝物群的合成，以便于細胞在該環(huán)境條件下生存下去。,如果某一特定代謝物過量合成，其所需要的初級代謝網(wǎng)絡(luò)某些途徑中的流量明顯不同于平衡生長條件下對應(yīng)的流量，這時碳架物質(zhì)相對集中地經(jīng)載流途徑

45、流向該目的產(chǎn)物。載流途徑是代謝網(wǎng)絡(luò)中的一部分途徑首尾相銜接形成的一條從原料化合物到目的產(chǎn)物的途徑(它一般包括原料化合物(碳架物質(zhì))胞外降解和進入細胞、碳架物質(zhì)經(jīng)胞內(nèi)進一步降解或轉(zhuǎn)換存在方式進入中心代謝途徑,中心代謝途徑的一部分，目的產(chǎn)物合成途徑，以及目的產(chǎn)物排出細胞等五個階段)。,例如以葡萄糖為主要碳源合成賴氨酸(Lys)時其載流途徑可簡述為:葡萄糖→6-磷酸葡萄糖→3-磷酸甘油醛→磷酸烯醇式丙酮酸→草酰乙酸→天冬氨酸-B-半醛→

46、賴氨酸(胞內(nèi))→賴氨酸(胞外),這個載流途徑處于代謝網(wǎng)絡(luò)中，與網(wǎng)絡(luò)中的其它途徑有很多交叉，也就是說載流途徑的許多中間化合物處于網(wǎng)絡(luò)的分叉處，兩個或多個反應(yīng)序列交匯或分流處被稱為載流途徑上的節(jié)點（這也意味著碳架物質(zhì)流量可在節(jié)點處發(fā)生變化）。,主要節(jié)點,雖然載流途徑的全部酶和蛋白質(zhì)(包括膜上載體蛋白)的活性控制著產(chǎn)物合成速率，但產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率控制主要取決于載流途徑上代謝中間物分支點即節(jié)點的流量分配功能?？砂旬a(chǎn)物形成時流量分配發(fā)生明顯改變的節(jié)點判

47、為主要節(jié)點。在賴氨酸合成的載流途徑中大約有30個節(jié)點，但當(dāng)賴氨酸轉(zhuǎn)化率從35%升至75%時，流量分配的明顯改變僅發(fā)生在三個節(jié)點：6-磷酸葡萄糖，磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸。,代謝網(wǎng)絡(luò)與代謝工程的關(guān)系,代謝工程把細胞作為一個完整的單元來分析研究,它強調(diào)整個代謝(包括輸送、產(chǎn)能、生物合成、生物裝配等反應(yīng)途徑),而不是單個反應(yīng)。正因為如此,代謝工程涉及整個生物反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)以及途徑合成、熱力學(xué)可行性、途徑流量和流量控制等一系列問題。,代謝工程要解

48、決的主要問題是改變某些途徑中的碳架物質(zhì)流量或者改變碳架物質(zhì)流在不同途徑中的流量分布。代謝工程的目標(biāo)是修飾初級代謝,將碳架物質(zhì)流導(dǎo)入目的產(chǎn)物的載流途徑以獲得產(chǎn)物的最大轉(zhuǎn)化率。在大自然設(shè)定的條件下進化而形成的代謝網(wǎng)絡(luò)對實際應(yīng)用中具有重要性的目的產(chǎn)物的過量合成來說,在遺傳上并不是最適的 。因此工業(yè)微生物學(xué)家試圖通過對細胞進行遺傳修飾來改變生物過程的運行,以實現(xiàn)目的產(chǎn)物的過量合成。,1）代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的基本類型 代謝網(wǎng)絡(luò)和亞網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)

49、可以抽象為兩種基本類型，即獨立型和依賴型 如果網(wǎng)絡(luò)或亞網(wǎng)絡(luò)中的每一個節(jié)點都依照化學(xué)計量規(guī)則將代謝物轉(zhuǎn)化為終端產(chǎn)物的組成部分，那么這樣的網(wǎng)絡(luò)或亞網(wǎng)絡(luò)就被認為是依賴型的。,2、代謝網(wǎng)絡(luò)分析,,在這種網(wǎng)絡(luò)中，各分支途徑的代謝流均需達到化學(xué)計量的平衡，保證除終端產(chǎn)物之外的細胞內(nèi)代謝物不積累、不分泌。在此限制下，組成此網(wǎng)絡(luò)的全部主要節(jié)點處的流量分配必須協(xié)調(diào)，并且所有主要節(jié)點必須視為同樣重要。,反之，若由主要節(jié)點流出的代謝物

50、不能完全合成終端產(chǎn)物，則認為該網(wǎng)絡(luò)是獨立型的。就此類網(wǎng)絡(luò)而言，只要改變在某一節(jié)點上的代謝物流量分配就有可能提高終端產(chǎn)物的產(chǎn)率。如果代謝網(wǎng)絡(luò)的主節(jié)點不集中，稱為獨立網(wǎng)絡(luò)，則可以通過對代謝途徑的修飾等來影響產(chǎn)物的積累,在一個簡單的雙節(jié)點網(wǎng)絡(luò)中,對于獨立型網(wǎng)絡(luò),節(jié)點1或2處的流量分配向有利于形成產(chǎn)物P的方向改變，能提高目的產(chǎn)物P的轉(zhuǎn)化率；但在依賴型網(wǎng)絡(luò)中，若要提高轉(zhuǎn)化率，這兩個節(jié)點的流量分配都必須改變。,2）節(jié)點的分類 根據(jù)

51、節(jié)點處代謝流量的調(diào)控機制及其特性，可將節(jié)點分為三類。 （1）柔性節(jié)點（Flexible Node） （2）強剛性節(jié)點（Strongly Rigid Node） （3）弱剛性節(jié)點（Weakly Rigid Node）,（1）柔性節(jié)點（Flexible Node） 若流經(jīng)每一分支的流量容易改變以滿足代謝需求，則這樣的節(jié)點成為柔性節(jié)點，導(dǎo)向每一分支的反應(yīng)速度也相近，每一分支的流量受相應(yīng)的終端產(chǎn)物反饋抑制控制，節(jié)

52、點的力量分割率可以從零變化到滿足合成末端產(chǎn)物所需求的水平。 對于分支流量分布的改變，柔性節(jié)點是最“順從”的。換言之，在柔性節(jié)點，主副產(chǎn)物均有自身反饋抑制，流量容易改變。,解除一個分支的反饋抑制可提高分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量，即柔性分支點傾向于更適應(yīng)通量分配比的變化,柔性節(jié)點的主要特點是經(jīng)受得起流量分配的改變，而且這種改變幾乎不需要特殊的修飾，因此許多希望增加產(chǎn)物產(chǎn)率的代謝修飾均建立在主要節(jié)點為柔性的基礎(chǔ)之上。許多研究表明，氨基酸

53、生物合成途徑中的許多分支節(jié)點均具有這種柔性，這對于利用代謝工程技術(shù)改良氨基酸產(chǎn)生菌的性能來說是非常重要的。,（2）強剛性節(jié)點（Strongly Rigid Node） 若一個節(jié)點的一個或多個分支途徑的流量分割率受到嚴(yán)格控制，那么這類節(jié)點就稱為強剛性節(jié)點。 也就是說，強剛性節(jié)點的流量分配是很難改變的，除非對相關(guān)分支途徑中的各種酶動力學(xué)特征進行全方位的修飾才可實現(xiàn)。換言之，在強剛性節(jié)點，主、副產(chǎn)物均有反饋抑制，相互有激活作用

54、，流量穩(wěn)定且難以改變。,（3）弱剛性節(jié)點（Weakly Rigid Node） 若一個節(jié)點的流量分配由它的某一分支途徑的分支動力學(xué)所控制，則稱該節(jié)點是弱剛性節(jié)點,由于代謝網(wǎng)絡(luò)中剛性節(jié)點的存在，對為提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率而進行的干擾的結(jié)果產(chǎn)生復(fù)雜的影響。,主要節(jié)點剛性和評估,一旦網(wǎng)絡(luò)中關(guān)于目的產(chǎn)物的主要節(jié)點已被識別,必須對它們的剛性程度進行評估。若能獲得生物體的生物化學(xué)的網(wǎng)絡(luò)圖表中全部酶的詳細的動力學(xué)表達式,則可建立一個關(guān)于代謝的

55、數(shù)學(xué)模型。借助這一模型,用代謝網(wǎng)絡(luò)或亞網(wǎng)絡(luò)的模型通過比較對主要節(jié)點的剛性進行評估。,,即通過比較在穩(wěn)定狀態(tài)下的流量分配和為提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率而進行的干擾下同一網(wǎng)絡(luò)中的流量分配進行評估。在已確定主要代謝節(jié)點的類型的基礎(chǔ)上提出代謝改變的方案。以模擬為基礎(chǔ)的評估技術(shù)的明顯缺點是關(guān)于動力學(xué)的詳細信息是有限的，即使有了動力學(xué)信息，其在活體中的應(yīng)用也并不是容易建立的。,,主要節(jié)點上流量分配限制產(chǎn)物生產(chǎn)能力的程度可通過對靠近此節(jié)點的一個分支進行干擾，對

56、所得的本區(qū)域流量分布和在額定條件下的觀察到的對應(yīng)數(shù)值進行比較，從而得到評估結(jié)果。若該節(jié)點處的流量分配能對干擾作出響應(yīng)而明顯改變方向和大小，則認為此節(jié)點是柔性的或是弱剛性的。反之，節(jié)點可能是強剛性的。,適合于產(chǎn)物合成的代謝流量的分析揭示，流量分配的修飾只需要發(fā)生在網(wǎng)絡(luò)的主要節(jié)點處。對它的遺傳修飾既可以用遺傳工程的方法,也可以用應(yīng)用分子生物學(xué)有關(guān)的“誘變—篩選”方法進行。如果在發(fā)酵生產(chǎn)中，也可以采取工藝措施，調(diào)整載流途徑上的流量。,代