代謝工程會議

1、基于動態(tài)代謝組學(xué)分析與合成途徑動力學(xué)模型的代謝途徑診斷方法的構(gòu)建與應(yīng)用,2015年微生物代謝工程與發(fā)酵工程學(xué)術(shù)研討會—無錫,報(bào)告人：劉龍江南大學(xué)生物工程學(xué)院2015-11-11,報(bào)告提綱,一、研究背景二、系統(tǒng)代謝調(diào)控Bacillus subtilis合成N-乙酰氨糖(GlcNAc)三、穩(wěn)態(tài)代謝組學(xué)定量解析B. subtilis工程菌代謝特性四、基于GlcNAc合成途徑動力學(xué)模型的代謝瓶頸診斷與解除五、研究結(jié)論,1. 發(fā)酵工程

2、與代謝工程,發(fā)酵工程與代謝工程的重要意義:發(fā)酵工程利用可再生資源生產(chǎn)燃料、工業(yè)化合物及功能營養(yǎng)品，實(shí)現(xiàn)綠色經(jīng)濟(jì)與低碳經(jīng)濟(jì)，微生物菌種選育和構(gòu)建是發(fā)酵工程的基礎(chǔ)和核心； 代謝工程已成為微生物菌種選育和構(gòu)建的重要手段，是發(fā)酵工程領(lǐng)域的一個重要分支和研究熱點(diǎn)。,,1.1 代謝工程研究的一般思路與方法,微生物代謝工程研究的一般思路:1、基于文獻(xiàn)/數(shù)據(jù)庫分析的目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑理性設(shè)計(jì)； 2、代謝產(chǎn)物(目標(biāo)產(chǎn)物、副產(chǎn)物)合成途徑的局部調(diào)控；

3、3、工程菌生產(chǎn)特性及代謝網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)優(yōu)化與全局調(diào)控；4、動力學(xué)/組學(xué)分析確定代謝瓶頸，進(jìn)行新一輪代謝改造。,1.2 代謝途徑理性設(shè)計(jì)的一般思路,代謝途徑理性設(shè)計(jì)的一般思路:1、文獻(xiàn)/數(shù)據(jù)庫/化合物庫分析尋找合適的目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑(酶) 2、在微生物宿主高效表達(dá)目標(biāo)基因(微生物、動物、植物)3、若文獻(xiàn)/數(shù)據(jù)庫無合適的基因(酶)，需首先利用高通量篩選技術(shù)篩選獲 得目標(biāo)微生物4、利用比較基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定目標(biāo)產(chǎn)物合

4、成基因(簇)5、根據(jù)酶反應(yīng)特點(diǎn)利用計(jì)算機(jī)軟件模擬并合成人工途徑酶,1.3 代謝途徑優(yōu)化與調(diào)控一般思路與方法,代謝途徑優(yōu)化與調(diào)控一般思路:表達(dá)方式優(yōu)化(游離、整合)啟動子工程終止子工程轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控核糖體工程代謝途徑(酶)定向進(jìn)化空間支架構(gòu)建體外重構(gòu)反應(yīng)體系底物轉(zhuǎn)運(yùn)/產(chǎn)物輸出強(qiáng)化,表達(dá)方式優(yōu)化,啟動子工程,終止子工程,轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,核糖體工程,代謝途徑(酶)進(jìn)化,空間支架構(gòu)建,體外重構(gòu)反應(yīng)體系,底物轉(zhuǎn)運(yùn)/產(chǎn)物輸出途徑強(qiáng)化

5、,代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)優(yōu)化與整體調(diào)控常用方法:全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程模塊途徑工程全基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建與調(diào)控代謝通路定位工程,1.4 代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)優(yōu)化與整體調(diào)控一般思路與方法,1.5 代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析的一般方法及不足,代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析方法：基于穩(wěn)態(tài)組學(xué)數(shù)據(jù)分析和預(yù)測靶點(diǎn)基于穩(wěn)態(tài)流量平衡分析的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測限速步驟胞外重構(gòu)代謝途徑分析合成動力學(xué)、鑒定限速步驟目前合成途徑起始階段動力學(xué)以及反應(yīng)動力學(xué)模型的研究方法未建立

6、。,胞內(nèi)代謝物動力學(xué)是細(xì)胞代謝狀態(tài)最直接的體現(xiàn)，利用穩(wěn)態(tài)代謝網(wǎng)絡(luò)分析可發(fā)現(xiàn)代謝瓶頸/代謝異常，但不能解釋代謝瓶頸/代謝異常產(chǎn)生的原因。在穩(wěn)態(tài)代謝組學(xué)分析的基礎(chǔ)上，將動態(tài)代謝組學(xué)和合成途徑動力學(xué)模擬相結(jié)合能鑒定代謝瓶頸/異常及其產(chǎn)生原因，提高對限速步驟的調(diào)控能力。,Analyzing transcriptome, proteome and metabolome in steady state for identifying engine

7、ering target,2. 代謝調(diào)控B. subtilis 生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc),醫(yī)藥領(lǐng)域，治療關(guān)節(jié)炎營養(yǎng)保健，延緩衰老化妝品，促進(jìn)膠原蛋白生成,N-乙酰氨基葡萄糖應(yīng)用領(lǐng)域,B. subtilis 作為生產(chǎn)菌株的優(yōu)勢,可用來生產(chǎn)食品安全級產(chǎn)品遺傳背景清晰代謝改造技術(shù)成熟不易受噬菌體污染，適于工業(yè)化生產(chǎn),2.1 氨糖合成途徑設(shè)計(jì)與構(gòu)建—glmS和GNA1基因克隆表達(dá),過量表達(dá)氨糖合成酶(GlmS)和6-磷酸

8、氨糖乙酰化酶(GNA1)實(shí)現(xiàn)了氨基葡萄糖GlcN和N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc的初步積累(240 mg/L)。,枯草芽孢桿菌中GlcNAc合成與代謝途徑,,,nagP基因敲除流程圖,敲除nagP基因阻斷了GlcNAc由胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)敲除nagA、nagB和gamA三個基因進(jìn)一步阻斷胞內(nèi)GlcNAc降解途徑促進(jìn)GlcNAc胞外積累，產(chǎn)量提高了17倍,2.1 氨糖合成途徑設(shè)計(jì)與構(gòu)建—GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)及分解代謝阻斷,驗(yàn)證nagA、nag

9、B和gamA基因敲除成功,2.2 氨糖合成途徑優(yōu)化與調(diào)控—GlcNAc合成途徑(酶)定向進(jìn)化,氨基葡萄糖合成酶GlmS結(jié)構(gòu)模型,氨基葡萄糖N-乙酰化酶GNA1結(jié)構(gòu)模型,突變體對細(xì)胞生長和GlcNAc合成的影響,2.2 氨糖合成途徑優(yōu)化與調(diào)控—GlcNAc合成關(guān)鍵酶表達(dá)調(diào)控,,GlmS和GNA1的啟動子系統(tǒng)優(yōu)化 (游離/整合表達(dá)、表達(dá)強(qiáng)度適配),構(gòu)建基于DNA與鋅指蛋白質(zhì)之間的特異性相互作用的支架系統(tǒng)對GlmS 和Gna1的表達(dá)進(jìn)行區(qū)域化

10、調(diào)控,GlcNAc在3-L發(fā)酵罐上GlcNAc產(chǎn)量達(dá)20.6 g/L,2.2 氨糖合成途徑優(yōu)化與調(diào)控—葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝途徑調(diào)控,分別敲除glcP基因和EIIA(yyzE、ypqE)基因阻斷NPTS和PTS葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)利用PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)更有利于GlcNAc合成，但丙酮酸積累，細(xì)胞生長慢敲除丙酮酸激酶(pyk)和PEP羧化酶(pckA)降低丙酮酸合成，GlcNAc產(chǎn)量提高60%,2.2 氨糖合成途徑優(yōu)化與調(diào)控—中心代謝途徑調(diào)控,分別敲

11、除ldh基因和eutD基因阻斷乳酸和乙酸的合成敲除alsS、alsD和bdhA阻斷乙偶姻的合成為保持氧化還原平衡，整合表達(dá)NADH氧化酶，在3-L發(fā)酵罐上GlcNAc產(chǎn)量達(dá)37g/L,表達(dá)anti-pfk sRNA，控制糖酵解模塊活性在中等水平(60%)表達(dá)anti-glmM sRNA，限制肽聚糖合成糖酵解模塊活性在中等水平(60%)共表達(dá)anti-pfk sRNA以及anti-glmM sRNA及Hfq蛋白，限制肽聚糖、糖

12、酵解模塊活性在低水平(30%),sRNA能夠有效限制GlcNAc合成競爭模塊（糖酵解及肽聚糖模塊）,2.3 氨糖代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)優(yōu)化與調(diào)控-構(gòu)建sRNA調(diào)控工具,通過將不同活性模塊進(jìn)行優(yōu)化組裝，GlcNAc搖瓶產(chǎn)量達(dá)到8.30 g/L，在3-L發(fā)酵罐上產(chǎn)量達(dá)到42 g/L。,2.3 氨糖代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)優(yōu)化與調(diào)控-基于sRNA的模塊調(diào)控,3. 基于代謝組學(xué)與合成途徑動力學(xué)模型的診斷方法的構(gòu)建,穩(wěn)態(tài)代謝組學(xué)系統(tǒng)分析高產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株的胞內(nèi)代謝差異

13、，鑒定代謝瓶頸和代謝異常動態(tài)代謝組學(xué)及合成途徑動力學(xué)模擬分析產(chǎn)物合成瓶頸產(chǎn)生原因13C同位素分析進(jìn)一步驗(yàn)證合成瓶頸，并進(jìn)一步通過代謝調(diào)控解除代謝瓶頸,,,3.1 穩(wěn)態(tài)代謝組學(xué)解析細(xì)胞代謝特性,工程菌代謝物水平發(fā)生何種變化? F6P和Gln過量消耗是否影響菌體生長?,,F6P和Gln,,GlcNAc 合成,,中心碳代謝及氮代謝,GlcNAc合成途徑及野生菌株與GlcNAc過量合成菌株BSGN細(xì)胞生長比較,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量

14、解析,濃度顯著變化代謝物,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量解析,工程菌BSGN與野生菌B. subtilis 168胞內(nèi)代謝物變化,糖酵解途徑、氨基酸合成以及TCA循環(huán)代謝物水平顯著降低，F(xiàn)6P和Gln降低2倍以上 ；胞內(nèi)GlcNAcP 升高570倍。,,何種過量消耗前體(F6P或Gln)對工程菌BSGN代謝影響更為關(guān)鍵 ?,,,,,GlcNAc 合成及糖酵解途徑,TCA循環(huán),氨基酸合成,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量解析,減少中心碳代謝F6P

15、對代謝變化的影響,在F6P代謝節(jié)點(diǎn)處減少底物對中心代謝途徑供給，對胞內(nèi)糖酵解途徑、氨基酸合成以及TCA循環(huán)的代謝物濃度無明顯影響。F6P供給非引起細(xì)胞生長和代謝變化的關(guān)鍵因素。,,F6P,,GlcNAc合成,在基因組Pfk引入突變(R252A)，降低其活性,,中心代謝,,Kinetics of PFK,Kinetics of PFK R252A mutant,,,,,如果F6P為關(guān)鍵因素，進(jìn)一步減少F6P中心碳代謝水平應(yīng)進(jìn)一步降低。,

16、GlcNAc 合成及糖酵解途徑,TCA循環(huán),氨基酸合成,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量解析,增加Gln供給對代謝變化的影響,代謝水平幾乎全部得到恢復(fù)，但細(xì)胞生長仍然較慢,,Pfk突變和GS過量表達(dá)對工程菌能荷水平是否有影響?,過量表達(dá)Gln合成酶，增加Gln供給,Gln,Glu,Ac-CoA,CoA,,Glucose,Glc-6-P,Fru-6-P,GlcN-6-P,GlcNAc-6-P,?,GlcNAc,,,,,,,Glycolysis,

17、GS,,GlcNAc 合成及糖酵解途徑,TCA循環(huán),氨基酸合成,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量解析,Pfk 突變對細(xì)胞能荷無明顯影響；GlcNAc過量合成對中心碳、氮代謝的影響不是限制細(xì)胞生長的關(guān)鍵因素。,細(xì)胞能荷、比生長速率、比產(chǎn)物合成速率比較,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量解析,,胞內(nèi)GlcNAc6P升高570倍,Glucose,Glc-6-P,Fru-6-P,PTS uptake pathway,過量磷酸糖對細(xì)胞有毒害作用:抑制葡萄糖

18、吸收避免過量磷酸糖積累可解除抑制作用。,Glucose,,GlcNAc合成過程中，GlcNAc途徑代謝物如何動態(tài)變化?,GlcNAc6P為工程菌產(chǎn)物合成及細(xì)胞生長的潛在瓶頸?,,4.1 GlcNAc合成途徑動力學(xué)分析,將動力學(xué)模型與系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合是分析代謝調(diào)控機(jī)理的重要手段建立GlcNAc合成途徑動力學(xué)模型結(jié)合動態(tài)代謝組學(xué)鑒定合成途徑中的瓶頸驗(yàn)證并且去除合成途徑中瓶頸進(jìn)一步促進(jìn)GlcNAc合成,4.2 GlcNAc合成途徑動

19、力學(xué)分析—動力學(xué)模擬,GlcNAc合成途徑化學(xué)計(jì)量數(shù)的微分方程組,4.2 GlcNAc合成途徑動力學(xué)分析—動力學(xué)模擬,無限速步驟,反饋抑制,某一反應(yīng)速率低于其他反應(yīng)速率,反應(yīng)途徑中存在無效循環(huán),產(chǎn)物輸出能力不足,反應(yīng)途徑末端存在無效循環(huán),4.2 GlcNAc合成途徑動力學(xué)分析—動力學(xué)模擬,不同限速步驟及其代謝途徑動力學(xué)特征：反饋抑制：代謝物濃度低于Km值，且無法達(dá)到穩(wěn)態(tài)；代謝途徑中存在限速反應(yīng)及無效循環(huán)：上游代謝物積累；代謝

20、途徑末端存在無效循環(huán)：胞內(nèi)、胞外產(chǎn)物總濃度降低；產(chǎn)物輸出效率不足：胞內(nèi)產(chǎn)物積累。,𝑣(2)=𝑣(2)𝑚𝑎𝑥 𝑥(1) 𝐾𝑚2+𝑥(1),𝑣 1 =0 for time 1,𝑣(3)=𝑣(3)𝑚𝑎𝑥

21、 𝑥(2) 𝐾𝑚3+𝑥(3) ...,,4.3 GlcNAc合成途徑動力學(xué)分析—動態(tài)代謝組學(xué),動態(tài)代謝組學(xué)測定：1) 通過底物添加，開啟產(chǎn)物合成途徑；2) GlcNAc比合成速率保持恒定，達(dá)到7.7 mg/g DCW/h。該GlcNAc比合成速率與重組菌BSGN在使用基本培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵時的GlcNAc比合成速率相近；3) 基于代謝組學(xué)采用快速取樣及高效

22、淬滅的方法對GlcNAc合成途徑開啟后2 min之內(nèi)的動力學(xué)進(jìn)行分析。,,4.4 GlcNAc合成途徑動力學(xué)分析—限速步驟預(yù)測,,,氨糖途徑動力學(xué)變化符合GlcNAc-6-P與GlcNAc無效循環(huán)模型模擬特征F6P、AcCoA和Gln濃度大于途徑酶Km值，底物供給充足非限制性因素未知激酶催化胞內(nèi)GlcNAc的磷酸化生成6-P-GlcNAc,4.5 GlcNAc合成途徑動力學(xué)分析—預(yù)測結(jié)果驗(yàn)證,若存在將胞內(nèi)GlcNAc磷酸化為GlcN

23、Ac-6-P的代謝流時，添加[U-13C]葡萄糖開啟GlcNAc合成途徑，GlcNAc-6-P來源于胞內(nèi)GlcNAc而不是[U-13C]葡萄糖。當(dāng)添加[U-13C]葡萄糖開啟GlcNAc合成途徑后，未被13C標(biāo)記的GlcNAc-6-P質(zhì)量同模子M+0的分?jǐn)?shù)始終保持在100%，而被13C標(biāo)記的GlcNAc-6-P質(zhì)量同模子M+6和M+8的分?jǐn)?shù)沒有增加。,4.6 GlcNAc合成途徑動力學(xué)分析—限速步驟去除,B. subtilis已注釋基

24、因中尚無GlcNAc激酶的注釋。將E. coli中GlcNAc激酶的氨基酸序列與B. subtilis中106個激酶的氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)葡萄糖激酶GlcK與E. coli中GlcNAc激酶的氨基酸序列相似度最高(26%)。敲除葡萄糖激酶編碼基因glcK，在基本培養(yǎng)基中細(xì)胞比生長速率(0.15 h-1)及氨糖生產(chǎn)強(qiáng)度(9.33 mg/L/h)為敲除前的2.1和2.3倍。,5、研究結(jié)論,建立GlcNAc合成途徑動力學(xué)模型，模擬不同限

25、速步驟存在時GlcNAc合成途徑由關(guān)閉到開啟狀態(tài)時動力學(xué)，并且鑒定了不同限速步驟存在時的動力學(xué)特征。通過控制底物葡萄糖添加，實(shí)現(xiàn)GlcNAc合成途徑由關(guān)閉到開啟。采用快速取樣、高效淬滅以及靶向代謝組學(xué)，實(shí)現(xiàn)對GlcNAc合成途徑開啟后2 min之內(nèi)的動態(tài)代謝組學(xué)測定。將實(shí)驗(yàn)測定GlcNAc合成途徑動力學(xué)與動力學(xué)模擬結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)GlcNAc-6-P與胞內(nèi)GlcNAc之間存在無效循環(huán)為GlcNAc合成途徑潛在限速步驟。進(jìn)一步使

26、用[U-13C]葡萄糖動態(tài)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)了無效循環(huán)存在。通過敲除重組菌BSGN中葡萄糖激酶編碼基因glcK，胞內(nèi)GlcNAc轉(zhuǎn)化為GlcNAc-6-P的無效循環(huán)得以阻斷，細(xì)胞比生長速率和GlcNAc生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了2.1倍和2.3倍。,相關(guān)發(fā)表論文,Liu et al., Biotechnology and Bioengineering. 2015. In revisionLiu et al., Critical Reviews in

27、 Biotechnology. 2015. Accepted/In press. Yin et al., Biotechnology Advances. 2015. 33: 830-841.Liu et al., Applied Environmental Microbiology. 2015. 81:2256-2264Han et al., Biotechnology Advances. 2014. 32: 415-428.

28、Liu et al., Metabolic Engineering. 2014, 24: 61-69.Liu et al., Metabolic Engineering. 2014, 23: 42-52. Liu et al., Metabolic Engineering. 2013, 19: 107-115.Zhang et al., Metabolic Engineering. 2012, 14: 521-527.,謝謝！請