冬蟲夏草無(wú)性型的鑒定和生長(zhǎng)特性研究.pdf

1、冬蟲夏草是我國(guó)一種傳統(tǒng)的名貴中藥，具有極其重要的藥用價(jià)值。近年來(lái)由于天然冬蟲夏草被過(guò)度采集，已經(jīng)瀕臨滅絕危險(xiǎn)。供不應(yīng)求的矛盾促使人們尋找天然蟲草的替代物，冬蟲夏草無(wú)性型的分離和培養(yǎng)是有效途徑之一。 為此，本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)冬蟲夏草分離株進(jìn)行了分子鑒定，全面研究其培養(yǎng)特征，測(cè)定其有效成分，這些研究為冬蟲夏草無(wú)性型未來(lái)的商業(yè)化開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)，為人工培養(yǎng)蟲草菌絲體代替天然冬蟲夏草提供依據(jù)。 采用PCR及DNA測(cè)序的方法，對(duì)所保藏的冬蟲

2、夏草分離株rDNA ITS全序列進(jìn)行分析，該分離株和數(shù)據(jù)庫(kù)中AB067721(Hirsutella sinensis，日本)完全相同，與AJ309359(Hirsutella sinensis，貴州大學(xué))相比在544位多一個(gè)G，在83位C與AJ488274(Hirsutella sinensis，臺(tái)灣)的A相區(qū)別，以上結(jié)果表明分離株為冬蟲夏草的真正無(wú)性型-中國(guó)被毛孢。同時(shí)和蛹蟲草rDNA ITS序列進(jìn)行比較，相似性僅有76％，顯然屬于不

3、同的種。 對(duì)中國(guó)被毛孢的固體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在改良PDA上生長(zhǎng)速度最快；研究其對(duì)溫度的適應(yīng)性，18℃為最適溫度，25℃以上不能生長(zhǎng)，并首次以圖片說(shuō)明菌株的這個(gè)特征；首次運(yùn)用環(huán)境掃描電鏡觀察菌絲的顯微結(jié)構(gòu)，清晰顯示了分生孢子的大小、形狀和著生方式。詳細(xì)報(bào)道的中國(guó)被毛孢菌落特征為以后的無(wú)性型分離和鑒定提供可靠依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)探討了大量元素、微量元素和氨基酸對(duì)中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)的影響，確定 MgSO4·7H2O、FeCl3·6H

4、2O、賴氨酸、蛋氨酸能夠促進(jìn)生長(zhǎng)，其中Fe3+為主要影響因素；另外，對(duì)該菌株的液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)40天后改良PDB和PPDB中菌絲量最高，達(dá)到7.84-8.34g/L。且培養(yǎng)液顏色（棕褐色或黑色）越深，生長(zhǎng)越旺盛。這部分所積累的固、液培養(yǎng)數(shù)據(jù)是中國(guó)被毛孢進(jìn)一步培養(yǎng)工藝研究的基礎(chǔ)。 用反相高效液相色譜法測(cè)定中國(guó)被毛孢固體培養(yǎng)菌絲體腺苷和蟲草素含量，用苯酚-硫酸法測(cè)定蟲草多糖含量。結(jié)果表明，采用的乙腈-水梯度洗脫方法能將中國(guó)被