冬蟲夏草無(wú)性型培養(yǎng)與鑒定及其抗腫瘤機(jī)制的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)探討了人工冬蟲夏草無(wú)性型的培養(yǎng)；同時(shí)，對(duì)無(wú)性型進(jìn)行了鑒定，測(cè)定了其有效成分，并探討了人工冬蟲夏草抗腫瘤機(jī)制，為人工冬蟲夏草替代天然冬蟲夏草奠定了基礎(chǔ)。 收集冬蟲夏草子實(shí)體彈射的子囊孢子，將單個(gè)萌發(fā)孢子接種到培養(yǎng)基上，成功分離到冬蟲夏草菌。同時(shí)觀察了溫度、pH值、通氣、碳源、氮源和搖菌對(duì)菌絲生長(zhǎng)特性的影響，結(jié)果顯示冬蟲夏草菌絲體為需氧菌，生長(zhǎng)緩慢，可自發(fā)熒光，能分泌棕褐色樣物質(zhì)，最適溫度為15～18℃，pH值范圍為5～7，適

2、當(dāng)?shù)膿u菌可提高菌絲量，碳源和氮源對(duì)菌絲量有影響，適宜的碳源為淀粉、葡萄糖和甘露醇，最佳的氮源為復(fù)合氮源；用菌絲體和子囊孢子飼喂蝙蝠蛾幼蟲可獲得較高的僵蟲誘導(dǎo)率(70～76.6％)；免疫組化染色顯示菌絲體和僵蟲體內(nèi)的菌絲有共同的抗原。這些為冬蟲夏草人工培養(yǎng)、營(yíng)養(yǎng)的選擇及用免疫方法分析提供了有價(jià)值的資料。 采用PCR及DNA測(cè)序的方法，對(duì)不同產(chǎn)地的冬蟲夏草及其分離株和其相關(guān)種類的rDNAITS和5.8SRNA全序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明

3、冬蟲夏草和其分離株的序列相似性為97.5～100％，分離株與中國(guó)被毛飽相似性為98.4～99.7％，而與Stachybotrychartarum、Cordycepsmilitari、Tolypocladiumcaledonica、Cephalosporiummaydiss、Paecilomycessinensis、Verticilliumbulbillosum、相似性最高分別為78.9％、76.7％、72.2％、68.6％、62.8％、

4、59.5％，這些結(jié)果提示冬蟲夏草和分離株是同一品種的不同生長(zhǎng)階段，冬蟲夏草為有性階段，而其分離株為其無(wú)性階段，即為中國(guó)被毛飽。 用比色法測(cè)定了天然冬蟲夏草、人工培養(yǎng)的菌絲體和北蟲草甘露醇的含量，探討了搖菌和不同氮源對(duì)冬蟲夏草菌絲體甘露醇含量的影響。結(jié)果顯示天然冬蟲夏草的甘露醇含量高于菌絲體，而菌絲體的含量又略高于北蟲草；搖菌培養(yǎng)使菌絲和菌液中甘露醇含量降低；不同氮源培養(yǎng)基對(duì)菌液液和菌絲中的甘露醇有不同的影響，最佳氮源為復(fù)合氮源。

5、提示天然和人工冬蟲夏草均含有有效成分—甘露醇，人工冬蟲夏草甘露醇的含量受培養(yǎng)方式和營(yíng)養(yǎng)的影響，同時(shí)，這也為人工冬蟲夏草替代天然冬蟲夏草提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 硫酸—苯酚法測(cè)定了天然冬蟲夏草和菌絲體多糖含量及振蕩培養(yǎng)和不同氮源培養(yǎng)基對(duì)菌絲甘露醇的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌絲體的多糖含稍高于天然冬蟲夏草(p＞0.05)；振蕩培養(yǎng)抑制菌絲多糖產(chǎn)生，使菌絲多糖含量降低；氮源對(duì)菌絲多糖含量有影響，較適合的氮源為復(fù)合氮源。提示冬蟲夏草多糖的含量受培養(yǎng)方式和營(yíng)

6、養(yǎng)的影響，同時(shí)，也為人工冬蟲夏草替代天然冬蟲夏草提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 為了探討冬蟲夏草菌絲體水提液和多糖抗腫瘤細(xì)胞(SP2/0)作用機(jī)制，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，瓊脂電泳和流式細(xì)胞儀及Hoechst33342熒光染色觀察和分析了細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀分析了細(xì)胞周期，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)了不同處理樣品p53基因表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用冬蟲夏草菌絲體水提液和多糖處理培養(yǎng)SP2/0細(xì)胞能抑制其生長(zhǎng)，細(xì)胞分裂被阻滯在G1/G0期，且誘