非諾貝特改善糖尿病小鼠傷口愈合的炎性機(jī)制.pdf

1、研究目的:
　　 傷口愈合能力受損是糖尿病患者面臨的一個(gè)重要臨床問(wèn)題，并且是導(dǎo)致下肢截肢的首要原因。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是循環(huán)的未成熟細(xì)胞，可以遷移到受損或缺血部位參與血管新生，在血管維護(hù)和血管新生方面起著重要的作用。由于上述原因，EPCs對(duì)傷口愈合的影響越來(lái)越受重視。傷口愈合與血管新生密切相關(guān)，近年來(lái)，血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)

2、的抗血管生成的潛力已得到了確認(rèn)。TSP-1 mRNA的表達(dá)在糖尿病EPCs內(nèi)顯著升高。此外，TSP-1轉(zhuǎn)基因能降低微血管密度，減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和下調(diào)IL-1β的表達(dá)。研究表明，高糖能夠誘導(dǎo)IL-1β在內(nèi)皮細(xì)胞中合成。并且，葡萄糖誘導(dǎo)激活的硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)介導(dǎo)IL-1β mRNA的表達(dá)。TXNIP是高糖誘導(dǎo)下響應(yīng)最高的上調(diào)蛋白。TXNIP是活性氧(reac

3、tive oxygen species，ROS)清除劑硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)的一種內(nèi)源性抑制劑。氧化應(yīng)激是多種疾病包括糖尿病并發(fā)癥細(xì)胞損傷的介質(zhì)。這一過(guò)程還產(chǎn)生大量的超氧化陰離子O2，而O2生成增加又進(jìn)一步加速了NO的滅活。非諾貝特干預(yù)降低糖尿病事件研究(fenofibrate intervention and eventlowering in diabetes，F(xiàn)IELD)指出:非諾貝特治療可以降低截肢風(fēng)險(xiǎn)，尤其

4、是降低沒(méi)有已知大血管疾病未成年人的截肢風(fēng)險(xiǎn)，這很可能是通過(guò)非降脂機(jī)制來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)的。由于皮膚傷口預(yù)后不良最終可能導(dǎo)致截肢，所以本課題對(duì)非諾貝特是否能夠改善糖尿病小鼠傷口愈合進(jìn)行研究，圍繞炎癥介質(zhì)(TSP-1、IL-1β、TXNIP、ROS等)探索其改善傷口愈合可能的炎性機(jī)制。
　　 研究?jī)?nèi)容及結(jié)果:
　　 1.非諾貝特改善糖尿病小鼠傷口愈合
　　 雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為三組，即，對(duì)照組、鏈脲佐菌素(stre

5、ptozotocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病小鼠組和非諾貝特治療組（造模成功小鼠非諾貝特100mg/kg/d灌胃兩周）。在小鼠背部去除一塊直徑為6 mm的圓形皮膚，制造傷口模型。隔天拍照直至第12天并計(jì)算傷口面積。取第3、6、9天整個(gè)傷口皮膚制作石蠟切片進(jìn)行CD31免疫組化檢查。結(jié)果顯示:糖尿病小鼠傷口愈合速度大幅下降，血管新生數(shù)目降低;非諾貝特治療的糖尿病小鼠傷口愈合速度明顯加快，血管新生數(shù)目增加。
　　 2.非諾貝特對(duì)糖尿病小鼠

6、EPCs數(shù)目和功能的影響
　　 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血Sca-1和Flk-1雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞比例，以檢測(cè)EPCs數(shù)目。采用改良的Boyden小室分析法測(cè)定EPCs遷移能力。將EPCs置于Matrigel上，檢測(cè)其小管新生能力。發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠外周血EPCs數(shù)目明顯降低，BM-EPCs(Bone marrow EPCs)遷移和小管新生能力顯著下降;非諾貝特治療組外周血EPCs數(shù)目顯著增加，BM-EPCs遷移和小管新生能力顯著提

7、高。
　　 3.非諾貝特抑制糖尿病小鼠BM-EPCs內(nèi)炎癥介質(zhì)的表達(dá)
　　 利用Western Blotting的方法對(duì)小鼠BM-EPCs內(nèi)的TSP-1和TXNIP進(jìn)行檢測(cè)。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BM-EPCs內(nèi)NO和O2的含量。結(jié)果為:糖尿病小鼠BM-EPCs內(nèi)TSP-1、TXNIP和O2-的含量明顯增加而NO的含量明顯降低;非諾貝特治療組BM-EPCs內(nèi)TSP-1、TXNIP和O2-的含量明顯下降，NO的含量顯著升高。<

8、br>　　 4.非諾貝特抑制高糖誘導(dǎo)的BM-EPCs內(nèi)炎癥介質(zhì)的表達(dá)
　　 正常C57BL/6小鼠骨髓分離培養(yǎng)7天的EPCs，建立高糖(33 mmol/L葡萄糖)模型，分別給予非諾貝特1、5、10μmol/L處理，對(duì)BM-EPCs進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:高糖處理BM-EPCs的遷移和小管新生能力顯著降低，非諾貝特處理后能明顯抑制高糖對(duì)BM-EPCs遷移和小管新生的損傷作用。高糖處理BM-EPCs分泌的TSP-1和IL-Iβ明顯增多

9、，胞內(nèi)TXNIP和O2-表達(dá)也明顯升高，NO的含量則顯著降低。非諾貝特處理后BM-EPCs TSP-1和IL-1β分泌量明顯下降，胞內(nèi)TXNIP和O2表達(dá)也明顯降低，NO的含量明顯升高。給予PPAR-α(Peroxisome Proliferator-Activated Receptorα)拮抗劑MK886，非諾貝特仍能降低高糖刺激的IL-1β，說(shuō)明非諾貝特產(chǎn)生的這種抗炎作用與其激動(dòng)PPAR-α無(wú)關(guān)。
　　 結(jié)論: