電離輻射小鼠皮膚傷口愈合延遲的分子機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 創(chuàng)傷愈合是一個復雜的生物學過程，包括凝血、炎癥，組織的增生，組織改建與重塑三個階段[1];而細胞因子在愈合的整個過程中均發(fā)揮著重要的作用，急性創(chuàng)傷時，細胞因子能夠發(fā)揮正常功能參與愈合過程，最終使皮膚屏障功能得到重建;而在慢性傷口中，炎癥細胞持續(xù)浸潤導致傷口部位的蛋白水解環(huán)境改變，相關細胞因子被降解，使其未能發(fā)揮應有的功能，從而抑制了正常傷口的愈合過程。全身電離輻射(ionizing radiation，IR)作

2、為一種特殊的損傷，其可以引起造血細胞和修復細胞數量的減少與功能的減退，影響并損害愈合過程中的諸多環(huán)節(jié)，從而導致創(chuàng)面愈合延緩。此外，當IR損傷伴有燒傷、各種創(chuàng)傷等合并損傷時，導致最終形成電離輻射合并損傷（radiation combined injury, RCI）[2]。當前研究發(fā)現，該類傷口的愈合過程中可能存在細胞因子表達異常，而適量的、合理的運用細胞因子可以促進RCI的愈合，這不僅有利于組織的修復，而且可以提高傷口修復的質量。目前，

3、盡管局部使用細胞因子促進創(chuàng)傷愈合的方法有很多，但是在細胞因子的選擇及細胞因子的劑量上存在不同的觀點。此外，由于RCI屬于慢性損傷，在臨床治療中十分常見，如惡性腫瘤放療引起的皮膚潰瘍或放療后手術傷口，RCI存在傷口時，炎癥細胞的持續(xù)浸潤會導致傷口處形成蛋白水解酶的環(huán)境，外源性的細胞因子極易被降解，難以發(fā)揮促進傷口愈合的作用。因此，選擇合適的細胞因子、劑量和外源性細胞因子體內遞送方式，對促進RCI傷口愈合有著十分重要的意義。
　　

4、細胞因子是能在細胞間傳遞信息并且具有明顯免疫調控和效應功能的一類小分子生物活性多肽或糖蛋白[3]。細胞因子具有多效性、拮抗性、重疊性和協(xié)同性，它們相互作用調節(jié)創(chuàng)傷修復過程中的多種細胞反應，對細胞增殖、遷移、細胞外基質合成、分泌都具有重要的調控作用。當前研究表明，血管內皮生長因子-A(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF-A)、血小板源性生長因子-BB(Platelet-derivedGrowth

5、Factor，PDGF-BB)、腫瘤壞死因子-a(Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-a)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor，GM-CSF)等均是創(chuàng)傷愈合過程中重要的細胞因子，在傷口愈合的不同時期有著不同的表達水平[4]，但是當前對于這些細胞因子在RCI傷口中表達水平的研究較少;GM-CSF作為其中一個重要的細胞因子，

6、參與整個的創(chuàng)傷愈合過程，在創(chuàng)面愈合的炎癥階段它通過增加中性粒細胞的數量與功能而促進創(chuàng)面的炎癥反應;在血管形成過程中能夠促進內皮細胞遷移與增殖;還可以直接或通過IL-6間接作用角質形成細胞，刺激角質形成細胞增殖，促進再上皮化過程。在已有的糖尿病引發(fā)的慢性傷口治療研究中發(fā)現，局部GM-CSF治療可以有效促進慢性傷口的愈合，認為其可能成為將來治療慢性傷口的一種新的治療手段。目前缺乏GM-CSF治療RIC的研究報告。
　　 第一部分:電

7、離輻射損傷小鼠背部皮膚傷口愈合過程中多種細胞因子表達的觀察
　　 目的:通過檢測IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口中VEGF-A、PDGF-BB、TNF-a、GM-CSF的分子與蛋白水平的動態(tài)表達，從而探討各種細胞因子對IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合的影響。
　　 方法:在6 Gy60Coγ全身電離輻射小鼠背部制作1.5×1.5cm的皮膚缺損，建立IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口模型，分別在致傷后的1d、3d、5d、7d取傷口皮

8、膚組織，通過Real time-PCR方法檢測VEGF-A、PDGF-BB、TNF-a、GM-CSF mRNA的動態(tài)表達水平，應用免疫組化的方法檢測各種細胞因子蛋白表達情況。
　　 結果:Real time-PCR結果顯示:比較IR損傷組與正常對照組傷口愈合過程中傷口局部組織中VEGF-A、PDGF-BB、TNF-a、GM-CSF四個細胞因子mRNA的表達水平，IR損傷組存在明顯的表達異常，在傷后不同時間點上PDGF-BB mR

9、NA的表達均低于對照組，第3天時兩組表達差異較大(P＜0.01)，提示在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合過程中存在PDGF-BB表達水平降低;在第3天時，IR損傷組VEGF-A mRNA的表達明顯低于對照組(P＜0.05)，在第5天時對照組與IR損傷組均達到峰值，但IR損傷組表達低于于對照組，到第7天時對照組VEGF-A迅速下調，IR損傷組VEGF-A的表達高于對照組(P＜0.01)，提示提示IR會導致傷口組織VEGF-A mRNA表達

10、滯后;傷后7天中，IR損傷組TNF-a mRNA表達均高于對照組，在第7天時，IR損傷組mRNA表達明顯高于對照組(P＜0.01)，提示在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合過程中存在TNF-a過表達介導的異常炎癥反應;在傷后第1、3、5天，IR損傷組GM-CSF mRNA的表達水均明顯低于對照組(P＜0.01)，在傷后的第7天隨著對照組GM-CSF mRNA表達水平的下調，二者之間無明顯差異，提示IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合的遲滯與I

11、R損傷造成傷口局部GM-CSF的低表達有關。同樣，免疫組化結果表明VEGF-A、PDGF-BB、TNF-a、GM-CSF蛋白的表達變化趨勢與mRNA表達變化趨勢相吻合。
　　 結論:IR損傷可以造成皮膚缺損傷口局部多種細胞因子表達紊亂，其中包括生長因子表達的延遲及降低，直接抑制肉芽組織增生、血管生成;炎癥細胞因子表達紊亂造成炎癥發(fā)育延遲，周期延長。細胞因子表達紊亂既是IR的結果，也是導致RCI傷口愈合延遲的原因。
　　

12、第二部分:不同劑量rhGM-CSF殼聚糖-膠原蛋白水凝膠在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合過程中的療效評價
　　 目的:探討不同劑量的rhGM-CSF（1500ng/ml，6000ng/ml及10000ng/ml）殼聚糖-膠原蛋白水凝膠對IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合過程中的影響作用，進而尋找其最適的作用劑量。
　　 方法:我們在第一部分的實驗研究基礎上選擇rhGM-CSF作為體內介入藥物，分別在IR損傷小鼠背部皮膚缺

13、損傷口使用不同劑量的rhGM-CSF(1500ng/ml、6000ng/ml和10000ng/ml)殼聚糖-膠原蛋白水凝膠，連續(xù)局部給藥5天，1次/天，以局部使用不含rhGM-CSF的殼聚糖-膠原蛋白水凝膠的為對照，然后進行傷口愈合評價和相關細胞因子表達檢測。其中包括:①傷口愈合評價:動態(tài)描記實驗治療組與對照組傷口殘余面積，運用Image Pro plus v(1).5軟件系統(tǒng)對描記圖像進行分析，測量傷口愈合過程中皮膚缺損區(qū)殘余面積比的

14、變化;用Masson染色法檢測傷后第14天皮膚傷口膠原纖維的含量;②相關內源性細胞因子表達檢測:皮膚傷口取材組，IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口局部使用rhGM-CSF(10000ng/ml)凝膠后，通過Realtime-PCR檢測創(chuàng)口組織PDGF-BB、VEGF-A、TNF-a的mRNA表達水平。分析不同劑量的GM-CSF在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合過程的影響，進而尋找其最適本研究模型條件下的治療劑量。
　　 結果:①在IR

15、損傷小鼠背部皮膚缺損傷口傷后第14天時，rhGM-CSF1500ng/ml、rhGM-CSF6000ng/ml不同劑量的實驗治療組與空白對照組相比，小鼠背部殘余面積比均小于空白對照組(P＜0.01)，而rhGM-CSF10000ng/ml劑量的實驗組的殘余面積比卻大于空白對照組(P＜0.05);結果還顯示在前7天6000ng/ml劑量rhGM-CSF凝膠治療組比1500ng/ml劑量rhGM-CSF凝膠治療組起效快;提示局部給予外源性的

16、rhGM-CSF凝膠可以明顯改善IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口的愈合過程，且在一定劑量范圍內其濃度與治療功效成正比（rhGM-CSF6000ng/ml凝膠組優(yōu)于rhGM-CSF1500ng/ml)，但當rhGM-CSF劑量為10000ng/ml時，傷口愈合反而受到抑制;Masson染色法檢測傷后第14天皮膚傷口膠原纖維的含量結果:在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口使用不同劑量的rhGM-CSF(1500ng/ml、6000ng/ml和1000

17、0ng/ml)凝膠后，rhGM-CSF6000ng/ml凝膠組明顯優(yōu)于其他三組，膠原著色深，面積分布較為廣泛，排列緊密。②相關內源性細胞因子表達檢測結果:在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口使用rhGM-CSF劑量為10000ng/ml時，1d、3d、5d、7d Realtime-PCR結果顯示VEGF-A、PDGF-BB細胞因子的表達實驗組均低于對照組，提示在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口使用劑量rhGM-CSF10000ng/ml的凝膠，會

18、不同程度抑制其他細胞因子的表達。
　　 結論:細胞因子是調節(jié)RCI傷口愈合的關鍵因素，外源性GM-CSF傷口局部運用可以明顯影響RCI傷口愈合過程。本研究結果顯示:局部給予外源性的rhGM-CSF殼聚糖-膠原蛋白水凝膠可以明顯改善IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口的愈合過程，且在一定劑量范圍內其濃度與治療功效成正比（rhGM-CSF6000ng/ml凝膠組優(yōu)于rhGM-CSF1500ng/ml凝膠組）。就促進傷口愈合而言，外源性GM-