銀杏葉提取物對高脂飲食大鼠胰島素敏感性的影響及其相關(guān)機制研究.pdf

1、2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病呈逐年上升趨勢，胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是T2DM的重要發(fā)病基礎，而且與高血壓、高血脂、肥胖、心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有上述疾病的“共同土壤”之稱。 銀杏葉提取物(EGB)的臨床使用非常廣泛，在高脂血癥、老年癡呆癥、冠心病(CHD)、腦血管病的治療中療效顯著，目前其治療范圍逐漸擴展，開始在糖尿病并發(fā)癥、慢性阻塞性肺病、肝纖維化等疾病中應用，效果肯定。且其制劑有統(tǒng)

2、一的國際標準，這為其臨床使用的安全性提供了保障。 EGB可以調(diào)節(jié)血脂、改善糖代謝和內(nèi)皮細胞功能，并且具有抗氧化、清除自由基等多種藥理作用，這些環(huán)節(jié)均與IR的發(fā)生機制密切相關(guān)。因此，EGB可能對IR狀態(tài)有改善作用。為了證明這一推論，我們通過銀杏制劑對高脂飲食誘導的IR大鼠的干預研究，探討銀杏制劑對胰島素敏感性的影響及其作用的靶點。 目的：探討EGB對高脂飲食大鼠胰島素敏感性的影響及其可能的作用機制。主要研究內(nèi)容包括IR模型

3、的建立和評價；EGB對胰島素敏感性的改善及評估；EGB對糖、脂代謝的影響；對脂肪因子分泌的調(diào)節(jié)；對骨骼肌PKB、GLUT4以及脂肪組織PPAR7表達的影響。 方法：清潔級雄性Wistar大鼠(體重290～320g)80只，適應性喂養(yǎng)1周后按體重隨機分為正常對照組(normal control group，NC)20只，高脂飲食組(high-fat-fed group，HF)60只。正常對照組給予基礎飼料(熱量組成：碳水化合物占6

4、5.5％，脂肪占10.3％，蛋白質(zhì)占24.2％)，總熱量為348kcal/100g；高脂飲食組喂以高脂飼料(熱量組成為脂肪59.8％，碳水化合物20.1％，蛋白質(zhì)20.1％)，總熱量為501 kcal/100g。兩組每日等熱量投喂飼料，每周稱體重1次。4周后2組各隨機選10只大鼠禁食10小時過夜，內(nèi)眥取血，分離血清測定高脂飲食4周大鼠的血脂、空腹胰島素、瘦素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子α、游離脂肪酸等指標，并行高胰島素.正葡萄糖鉗夾實驗，了解

5、大鼠葡萄糖輸注率(GIR)的變化，判斷造模是否成功。確認造模成功后，高脂飲食組剩余50只大鼠按照體重隨機分為高脂對照組(HC)，銀杏葉1組(EGB1)，銀杏葉2組(EGB2)，銀杏葉3組(EGB3)，羅格列酮組(RSG)，每組10只，在原飼養(yǎng)條件的基礎上，開始藥物干預。其中銀杏葉1、2、3組分別給予舒血寧注射液4 mg·kg-1·d-1、8 mg·kg-1·d-1、12 mg·kg-1·d-1腹腔注射，RSG組給予馬來酸羅格列酮蒸餾水混

6、懸液3 mg·kg-1·d-1灌胃，NC組和HC組給予與EGB2組等量生理鹽水腹腔注射，每日1次，共4周。每周稱體重1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。療程結(jié)束后內(nèi)眥取血，分離血清，測定各組大鼠干預后血脂、空腹胰島素、瘦素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子α、游離脂肪酸等指標，其中血清瘦素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子α采用ELISA法測定；血清游離脂肪酸用銅顯色法測定。并行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)及干預后高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗，了解各組大鼠對葡萄糖負荷的

7、耐受情況及葡萄糖輸注率的變化。4周與8周的鉗夾結(jié)束后均放血處死大鼠，準確稱量腎周和附睪脂肪重量，與自身體重比作為內(nèi)臟脂肪相對含量。并分別留取大鼠股四頭肌和腎周或附睪脂肪，采用Western Blotting和實時熒光定量RT-PCR技術(shù)測定肌肉組織PKB、GLUT4以及脂肪組織PPARγ蛋白和mRNA表達情況。所得數(shù)據(jù)經(jīng)過整理采用SPSS統(tǒng)計軟件進行t檢驗或方差分析。 結(jié)果：1 高脂喂養(yǎng)4周末大鼠各項指標情況：與正常對照組相比，

8、高脂飲食組大鼠體重雖有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，血清總膽固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)及空腹胰島素升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空腹血糖、血清游離脂肪酸、腫瘤壞死因子α明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，葡萄糖輸注率、血清脂聯(lián)素下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)。血清瘦素升高，但與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高脂飲食組還表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪相對含量增加，與正常對照

9、組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與此同時，高脂飲食組大鼠骨骼肌PKB蛋白表達有下降趨勢，但與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.071)；骨骼肌GLUT4和脂肪組織PPARγ蛋白表達量減少，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 2.藥物干預4周后大鼠各項指標的變化： 2.1 血糖、血脂、血清胰島素及葡萄糖輸注率的變化。實驗結(jié)束時，高脂對照組大鼠血清TC、TG、FBG、FINS均顯著升高，G

10、IR明顯下降，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。經(jīng)藥物干預，羅格列酮組TC、TG、FBG、FINS均下降，GIR明顯升高，與高脂對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。銀杏葉各組上述指標改善程度不同，與高脂對照組比較，銀杏葉1組TC、TG下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；FBG、FINS、GIR變化不明顯(P>0.05)。銀杏葉2、3組TC、TG、FBG、FINS下降，GIR升高，與高脂對照組比較差異有統(tǒng)計學

11、意義(P<0.01)。與銀杏葉1組比較，銀杏葉2、3組TC、FINS下降(P<0.01)；銀杏葉3組GIR升高(P<0.05)。但銀杏葉2、3組與羅格列酮組TC、TG、FBG、FINS、GIR等指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 2.2 藥物干預后OGTT結(jié)果。高脂對照組大鼠0'及糖負荷后60'、120'血糖及曲線下面積(AUC)均升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與高脂對照組比較，銀杏葉1組0'、

12、120'血糖降低(P<0.05或P<0.01)：銀杏葉2、3組、羅格列酮組0'、120'血糖，AUC下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。銀杏葉2組60'血糖較羅格列酮組及銀杏葉1組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；銀杏葉3組120'血糖低于銀杏葉1組(P<0.05)。且高脂對照組大鼠存在糖負荷后血糖高峰延遲，120'血糖為測定范圍內(nèi)最高值。其它各組高峰均在30'或60'。 2.3 藥物干預后血清瘦素、脂聯(lián)

13、素、腫瘤壞死因子α、游離脂肪酸含量的測定。高脂對照組大鼠表現(xiàn)為血清游離脂肪酸、腫瘤壞死因子α升高，內(nèi)臟脂肪相對含量增加，脂聯(lián)素水平下降，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。血清瘦素有升高趨勢，但與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＝0.054)。藥物干預使血清游離脂肪酸、腫瘤壞死因子α下降，脂聯(lián)素水平升高。各藥物干預組上述指標與高脂對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其中在銀杏葉3組，游離脂肪酸水平下降最明顯

14、，與銀杏葉1組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。銀杏葉2、3組與羅格列酮組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。銀杏葉3組瘦素水平最低，且與銀杏葉1、2組、羅格列酮組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。銀杏葉2、3組血清脂聯(lián)素濃度升高明顯，與銀杏葉1組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。銀杏葉1組、銀杏葉3組、羅格列酮組間血清腫瘤壞死因子α水平差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。銀杏葉3組血清腫瘤壞死因子α明顯低于銀杏葉2組，差

15、異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。藥物干預使內(nèi)臟脂肪相對含量減少，與高脂對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，銀杏葉2、3組內(nèi)臟脂肪相對含量低于羅格列酮組及銀杏葉l組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但銀杏葉2、3組之間內(nèi)臟脂肪相對含量無差異(P>0.05)。 2.4 血清瘦素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子α、游離脂肪酸、內(nèi)臟脂肪相對含量與GIR的相關(guān)分析。血清腫瘤壞死因子α、游離脂肪酸、內(nèi)臟脂肪相對含量與GIR呈顯著負相關(guān)(P

16、<0.01或P<0.05)。血清脂聯(lián)素與GIR呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。血清瘦素與GIR相關(guān)性不顯著(P=0.13)。 2.5 藥物干預后大鼠骨骼肌組織PKB、GLUT4及脂肪組織PPARγ表達情況。 2.5.1 骨骼肌PKB表達情況 2.5.2 骨骼肌GLUT4表達情況 2.5.3 脂肪組織PPARγ的表達情況 結(jié)論： 1.高脂喂養(yǎng)大鼠血清總膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、空腹血糖、空

17、腹血清胰島素不同程度升高，葡萄糖輸注率降低，口服葡萄糖耐量實驗證實高脂喂養(yǎng)大鼠對糖負荷的處理能力下降。 2.銀杏葉提取物可以降低高脂飲食大鼠血清膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸，增加葡萄糖輸注率，調(diào)節(jié)糖耐量，改善高脂飲食大鼠的胰島素敏感性。 3.高脂飲食大鼠血清腫瘤壞死因子α、瘦素濃度升高，脂聯(lián)素水平降低，內(nèi)臟脂肪相對含量增加。葡萄糖輸注率與血清游離脂肪酸、腫瘤壞死因子α水平、內(nèi)臟脂肪相對含量呈顯著負相關(guān)，與血清脂聯(lián)素濃度呈

18、顯著正相關(guān)，與血清瘦素水平相關(guān)性不明顯。 4 高脂喂養(yǎng)使大鼠骨骼肌組織PKB、脂肪組織PPARγ蛋白水平呈下降趨勢。骨骼肌GLUT4蛋白及mRNA的表達下降，脂肪組織PPARγmRNA表達下降。 5 銀杏葉提取物可以調(diào)節(jié)脂肪因子腫瘤壞死因子α、瘦素、脂聯(lián)素的分泌，調(diào)節(jié)骨骼肌PKB、GLUT4和脂肪組織PPARγmRNA的表達并呈現(xiàn)出一定的劑量相關(guān)性，即中、高劑量銀杏葉提取物干預對胰島素敏感性及相關(guān)指標的改善作用優(yōu)于低劑量