幽門(mén)螺桿菌ArsRS信號(hào)標(biāo)簽突變體的構(gòu)建及STM文庫(kù)構(gòu)建方法的研究.pdf

1、目前，全球約50％的人口感染幽門(mén)螺桿菌（H.pylori），我國(guó)人口感染率高于世界平均水平，為50～70％。世界衛(wèi)生組織已將幽門(mén)螺桿菌列為第一類致癌因子，明確其為胃癌的危險(xiǎn)因素。因此，抗幽門(mén)螺桿菌感染的控制和治療是我們面臨的重要醫(yī)療和社會(huì)問(wèn)題。隨著Hpylori根除治療中抗生素的廣泛應(yīng)用，H.pylori的耐藥問(wèn)題突出。對(duì)于耐藥基因的鑒定，長(zhǎng)期以來(lái)多以藥靶基因和藥物代謝相關(guān)基因的分析為主，如：H.pylori對(duì)克拉霉素的耐藥性與克拉霉素

2、的作用位點(diǎn)23SrRNA基因（A2142G、A2143G）突變有關(guān)；H.pylori對(duì)甲硝唑耐藥是由于rdxA基因的突變失活，而rdxA基因編碼NADPH硝基還原酶，能使甲硝唑還原而生成具有殺菌活性的代謝產(chǎn)物。但這種方法不能全面發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)基因及其機(jī)制。因此新的耐藥性分析的方法和藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，是目前急需解決的重要課題。
　　信號(hào)標(biāo)簽突變技術(shù)（STM）能夠高通量篩選病原微生物的毒力相關(guān)基因，自1995年由Holden及其同事建立起

3、來(lái)，該技術(shù)已用于十多種病原微生物的致病基因的研究，它是通過(guò)用病原體全基因組隨機(jī)插入的突變體在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行高通量篩選，從而對(duì)病原體的毒力基因進(jìn)行鑒定的一種負(fù)向篩選方法。其理論基礎(chǔ)是：如果在與病原體致病過(guò)程有關(guān)的毒力基因中插入轉(zhuǎn)座子，產(chǎn)生的突變體就會(huì)由于毒力基因的插入失活而無(wú)法引起持續(xù)性感染，結(jié)果不能在宿主體內(nèi)存活下來(lái)。通過(guò)突變體庫(kù)感染宿主，然后對(duì)存活下來(lái)的突變體進(jìn)行負(fù)篩選就可鑒定出病原體的毒力相關(guān)基因。這種高通量篩選方法不僅是篩選鑒定致病

4、相關(guān)基因的有力手段，而且是篩選耐藥基因以及各種特定功能相關(guān)基因的有效方法。
　　雙組分系統(tǒng)是大部份細(xì)菌賦有的精密的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，由組氨酸蛋白激酶(HPK)和效應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(RR)兩個(gè)組分組成，其功能是感知環(huán)境變化并產(chǎn)生適當(dāng)?shù)募?xì)胞反應(yīng)，使之更好的適應(yīng)外界環(huán)境變化。研究表明，HpyloriArsRS雙組分系統(tǒng)是Hpylori能夠在胃黏膜內(nèi)長(zhǎng)期定植的最重要原因之一。因此，我們認(rèn)為ArsRS雙組分系統(tǒng)可能與Hpylori耐藥有一定關(guān)系。在A

5、rsRS雙組分系統(tǒng)中，酸敏感的組氨酸激酶ArsS(Hpylori0165)及其反應(yīng)元件ArsR(Hpylori0166)調(diào)控著Hpylori的大部分耐酸性基因：ureABEFGHI、α碳酸酐酶（CA）、NiKR、NixA、hypB、hypA、HspA、Fur、aspA；動(dòng)力性基因：flaABEGH；毒力基因cagA等，而這些基因是Hpylori生長(zhǎng)繁殖、致病、耐藥的關(guān)鍵，對(duì)這些基因的調(diào)控系統(tǒng)——ArsRS的研究有助于我們對(duì)Hpylori

6、致病及耐藥機(jī)制更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，我們用帶有標(biāo)簽的重組質(zhì)粒替代轉(zhuǎn)座子，通過(guò)PCR擴(kuò)增ArsS、ArsR基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆于載體pID700A1中，化學(xué)法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coliDH5α；然后將重組載體經(jīng)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化幽門(mén)螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，通過(guò)重組質(zhì)粒插入失活，成功構(gòu)建了ArsS和ArsR突變株。
　　我們通過(guò)在不同PH值的培養(yǎng)基上比較突變株與野生株的的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)ArsS、ArsR基因缺失會(huì)對(duì)幽門(mén)螺

7、桿菌生長(zhǎng)活性產(chǎn)生影響：當(dāng)PH值為7.0時(shí)，突變株克隆數(shù)與野生株克隆數(shù)無(wú)明顯差異，隨著PH值的逐漸降低，當(dāng)PH在6.0、5.0和4.0時(shí)，ArsS、ArsR突變株克隆數(shù)隨著PH值的逐漸降低而明顯減少，而野生株克隆數(shù)的變化則不明顯。我們還驚奇地發(fā)現(xiàn)，ArsS、ArsR突變株對(duì)藥物的敏感性明顯高于野生株，說(shuō)明ArsSR雙組分系統(tǒng)可能與Hp耐藥具有一定關(guān)系。
　　在ArsS、ArsR突變株構(gòu)建方法建立的基礎(chǔ)上，我們以四種限制性內(nèi)切酶酶切方