嗜肺軍團(tuán)菌血清10型信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)構(gòu)建.pdf

1、目的：本文通過(guò)PCR擴(kuò)增特異信號(hào)標(biāo)簽，導(dǎo)入載體質(zhì)粒pC6，構(gòu)建信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)穿梭質(zhì)粒pC6RS；通過(guò)細(xì)菌結(jié)合配對(duì)時(shí)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用，使特異信號(hào)標(biāo)簽隨機(jī)插入到嗜肺軍團(tuán)菌的基因組中，由此構(gòu)建嗜肺軍團(tuán)菌血清10型信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)，為篩選嗜肺軍團(tuán)菌血清10型毒力基因打下基礎(chǔ)。包括二部分：1、信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)穿梭質(zhì)粒構(gòu)建；2、嗜肺軍團(tuán)菌血清10型信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)的建立。 方法：實(shí)驗(yàn)一：信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)穿梭質(zhì)

2、粒構(gòu)建通過(guò)PCR擴(kuò)增信號(hào)標(biāo)簽(signature tags,STs)片段，導(dǎo)入載體質(zhì)粒pC6，構(gòu)建重組質(zhì)粒：pC6RS，電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌CCll8中，從CCll8中提取重組質(zhì)粒pC6RS后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌s17-1中，獲得信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)穿梭質(zhì)粒。 實(shí)驗(yàn)二：嗜肺軍團(tuán)菌血清10型信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)的建立含重組質(zhì)粒pC6RS的大腸桿菌s17-1與嗜肺軍團(tuán)菌L10結(jié)合配對(duì)，通過(guò)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用，將特意信號(hào)標(biāo)簽片段隨機(jī)插入到

3、軍團(tuán)菌的基因組中，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)依賴和抗性篩選建立嗜肺軍團(tuán)菌血清lO型信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一：信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)穿梭質(zhì)粒構(gòu)建通過(guò)PCR 擴(kuò)增信號(hào)標(biāo)簽(signature tags,STs)片段，導(dǎo)入載體pC6，構(gòu)建重組質(zhì)粒pC6RS，電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌CCll8中，從CCll8中提取重組質(zhì)粒pC6RS后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌s17-1中，獲得信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)穿梭質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)PCR、核苷酸序列測(cè)定鑒定，成功地構(gòu)建了pC

4、6RS質(zhì)粒。 實(shí)驗(yàn)二：嗜肺軍團(tuán)菌血清10型信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)的建立 經(jīng)過(guò)大腸桿菌S17-1與嗜肺軍團(tuán)菌血清10型的結(jié)合配對(duì)，通過(guò)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用，將特異信號(hào)標(biāo)簽片段隨機(jī)插入到軍團(tuán)菌的染色體上，經(jīng)篩選后建立嗜肺軍團(tuán)菌血清10型信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增及酶切鑒定，在構(gòu)建的信號(hào)標(biāo)簽誘變突變體文庫(kù)中，信號(hào)標(biāo)簽已成功插入到軍團(tuán)菌的基因組中。 結(jié)論：本研究用含特異性信號(hào)標(biāo)簽的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化供體菌后再與受體菌-嗜肺軍團(tuán)