氰戊菊酯對類固醇激素合成的影響及相關(guān)信號通路的研究.pdf

1、近年來，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)或內(nèi)分泌干擾化學物(EDCs)對人類生殖健康的影響已引起各國政府和許多學者的普遍關(guān)注。在美國國家環(huán)保局(USEPA)公布的EDCs中，農(nóng)藥)L-乎占了三分之二。中國作為一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥生產(chǎn)和使用量逐年增加，其中氰戊菊酯作為一種常用的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，因其能在環(huán)境中相對快速降解等優(yōu)點而被廣泛使用。然而，很多研究結(jié)果表明，氰戊菊酯可以對生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生損害作用。本研究利用體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)瘤細胞株(

2、MLTC-1)為染毒模型，側(cè)重于研究氰戊菊酯對孕酮合成的影響，并初步探討了cAMP和IGF信號通路在氰戊菊酯暴露導致類固醇激素合成變化中的作用。 第一部分氰戊菊酯對類固醇激素合成的影響目的觀察氰戊菊酯對類固醇激素合成的影響。 方法： 1.采用體外培養(yǎng)的小鼠睪丸間質(zhì)瘤細胞株(MLTC-1)作為染毒模型。 2.MTT法測定氰戊菊酯對MLTC-1細胞活力的影響，確定染毒劑量。 3.不同濃度氰戊菊酯染毒M

3、LTC-1 24h，在培養(yǎng)液中加入hCG(0.1U/L)繼續(xù)染毒4h，用放射免疫法(RIA)檢測培養(yǎng)液上清中的孕酮水平。 4.不同濃度氰戊菊酯染毒MLTC-1 24h，吸棄培養(yǎng)液，繼續(xù)用不合氰戊菊酯的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)液中加入hCG繼續(xù)培養(yǎng)4h，RIA檢測培養(yǎng)液上清中的孕酮水平。 結(jié)果： 1.根據(jù)MTT結(jié)果確定氰戊菊酯染毒劑量分別為：0、1、5、25和125μmol/L。 2.在hCG刺激下，氰戊菊

4、酯顯著抑制孕酮的合成，且呈劑量-反應關(guān)系。在125μmol/L組，孕酮下降了87.6％。 3.撤藥繼續(xù)培養(yǎng)24h后，各劑量組的孕酮水平無顯著性差異。 結(jié)論：氰戊菊酯顯著抑制MLTC-1類固醇激素的合成，撤藥后MLTC-1細胞合成類固醇激素的能力基本恢復。 第二部分氰戊菊酯抑制孕酮合成與cAMP依賴的蛋白激酶信號通路目的初步探討cAMP信號通路在氰戊菊酯抑制孕酮合成中的作用。 方法： 1.不同濃度氰戊菊酯染

5、毒MLTC-1細胞24h，培養(yǎng)液中分另《加入CT(30ng/ml)、forskolin(10μmol/L)和hCG(0.1U/L)繼續(xù)染毒4h，RIA法檢測細胞培養(yǎng)上清中的孕酮和cAMP水平。 2.不同濃度氰戊菊酯染毒MLTC-1細胞24h，培養(yǎng)液中分別加入8-Br-cAMP(500μmol/L)、22R-HC(25μmol/L)和孕烯醇酮(10μmol/L)繼續(xù)染毒4h，RIA法檢測細胞培養(yǎng)上清中的孕酮水平。 3.re

6、al-time RT-PCR測定類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)mRNA表達水平的變化。 4.蛋白印跡法(western blot)測定StAR、P450scc蛋白表達水平的變化。 結(jié)果： 1.在CT或forskolin刺激下，氰戊菊酯均顯著抑制孕酮的合成。 2.在hCG刺激下，氰戊菊酯顯著抑制MLTC-1細胞內(nèi)cAMP水平。但在CT或forskolin的刺激下，

7、這種抑制作用消失。 3.培養(yǎng)液中加入8-Br-cAMP后，氰戊菊酯仍抑制孕酮的合成。 4.在培養(yǎng)液中加入22R-HC后，氰戊菊酯仍抑制孕酮的合成；而加入孕烯醇酮之后，氰戊菊酯對孕酮的抑制作用消失。 5.氰戊菊酯染毒MLTC-1細胞24h后，StAR mRNA和蛋白水平均下降。 6.氰戊菊酯染毒MLTC-1細胞24h后，P450scc mRNA和蛋白水平均呈劑量，效應關(guān)系下降。 結(jié)論：氰戊菊酯顯著抑

8、制MLTC-1細胞孕酮的合成，其機制可能涉及cAMP-依賴的蛋白激酶信號通路。此外，氰戊菊酯還抑制膽固醇的跨線粒體膜轉(zhuǎn)運及P450scc的活性。 第三部分氰戊菊酯抑制孕酮合成與IGF信號通路目的初步探討IGF信號通路在氰戊菊酯抑制孕酮合成中的作用。 方法： 1.不同濃度氰戊菊酯染毒MLTC-1細胞24h，培養(yǎng)液中加入hCG繼續(xù)染毒4h，RT-PCR檢測IGF-1 mRNA的水平的變化。 2.不同濃度氰戊菊酯染毒M

9、LTC-1細胞24h，培養(yǎng)液中分別加入hCG、hCG+LY294002、hCG+U0126繼續(xù)染毒4h，RIA法檢測細胞培養(yǎng)上清中的孕酮水平。 3.不同濃度氰戊菊酯染毒MLTC-1細胞24h，培養(yǎng)液中加入hCG繼續(xù)染毒，western blot測定ERK1/2蛋白磷酸化表達水平的變化。 結(jié)果： 1.隨著氰戊菊酯染毒濃度的增加，在1μmol/L和更高劑量組，IGF-I mRNA的量顯著降低。 2.培養(yǎng)液中加